【背景】大型真菌是重要的食品和药物资源，可产生包括必需氨基酸在内的多种营养成分。谷氨酸是食用大型真菌中呈现鲜味的重要功能分子之一，是衡量食用菌营养价值的一个重要指标。【目的】基于伞菌目中谷氨酸合酶同源基因的保守性，对大型真菌中含有谷氨酸的菌株资源进行筛选，为野生大型真菌资源的挖掘以及谷氨酸产品的开发提供指导。【方法】本研究通过对伞菌目中已报道25株谷氨酸合酶基因序列进行比对分析，在谷氨酸合酶保守的外显子区域设计了2对简并引物分别为GS Ag＿les F1/R1和GS Ag＿les F2/R2，并将其用于对伞菌目13个科的65株大型真菌进行PCR筛选。另外本研究还采用异硫氰酸苯酯衍生化的方法结合LC-MS和HPLC对这65个菌株产生的谷氨酸进行了定量分析，进而评估了该筛选方法的筛选效率。【结果】本研究获得的筛选引物的筛选效率为86.2%，并且引物GS Ag＿les F1/R1的筛选效率明显优于GS Ag＿les F2/R2。优化后的伞菌目大型真菌谷氨酸发酵培养条件为：LMM培养基，28 ℃，200 r/min，2--4 d。结合PCR和HPLC的分析结果评估该引物筛选的真阳性率为81.5%，应用范围涉及到伞菌目的口蘑科、泡头菌科、伞菌科、丝膜菌科、粪伞科、离褶伞科、侧耳科、鬼伞科和鸟巢菌科等9个科。【结论】本研究获得的筛选引物在伞菌目产生谷氨酸的菌株筛选中显示出了良好的应用前景，为谷氨酸生产菌株提供了高效便捷的筛选技术方法。