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关键词 小干扰RNA 原发性肝癌
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.07.006
原发性肝细胞癌(PHCC)在世界范围内居常见肿瘤的第五位。近年来，随着分子生物学、免疫学、基因治疗学的发展，小干扰RNA（siRNA）以其特有的生物学特性及潜在的生物医学应用价值在PHCC治疗研究中成为热点。本文从siRNA的分子机制、原发性肝癌基因治疗原理及siRNA治疗肝癌的问题与展望几个方面做一阐述。
siRNA的背景及机制
siRNA相关背景：RNA是生物体内最重要的物质基础之一，它与DNA和蛋白质一起构成生命的框架。它可通过互补序列的结合反作用于DNA，从而关闭或调节基因的表达。甚至某些小分子RNA可以通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。
RNA干涉（RNAi）现象早在1993年就有报道，1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义RNA(antisense RNA)和正义RNA(sense RNA)都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。直到1998年，Andrew Fire的研究证明，在正义RNA阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA。于是提出了RNAi这个词。目前RNAi的作用机理主要是在线虫、果蝇、斑马鱼等生物体内阐明的［1］。
siRNA发生的分子机制：siRNA发生详细机制和过程目前还不完全清楚，大致分为以下几个阶段进行。①siRNA的形成阶段：此阶段需要Rde-1、Rde-4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dicer等共同参与。Rde-1、4编码的蛋白识别外源dsRNA，引导dsRNA与Dicer结合，然后，Dicer将dsRNA解旋，再将其裂解为21-25nt大小的siRNA。Dicer定位于胞浆中，但核内mRNA剪切修饰后在向核外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为21-25nt大小并在3′端带有2-3个碱基悬端且5′端磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应最强。Dicer家族在进化上非常保守，有N-端RNA解旋酶结构域、1个PAZ结构域(PAZ)、2个RNase Ⅲ结构域和C端dsRNA结合基序5个组成部分［2］。②RNA诱导的沉默复合物(RISC)形成阶段：生成的siRNA和RNAi特异性酶如AGO-2、MUT-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶结合形成RISC，具有序列特异性核酸内切酶、核酸外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与siRNA同源的靶mRNA。③效应阶段：siRNA引导RISC与同源性的mRNA结合，在ATP及解旋酶(如qde-3、mut-6、mut-14)的作用下使siRNA链解离，并使RISC由250kD大小的前体形式变成约100kD左右活性形式，同时解旋酶催化同源mRNA与siRNA的正义链相互交换，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5′起始端下游7-10个核苷酸处切断mRNA，起到特异的抑制基因表达的效果。④扩增阶段：该反应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA为摸板，在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下，扩增靶mRNA，产生新的二级siRNA，而这些siRNA又能继续反作用于靶mRNA［3］。RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数，而且能将异常的单链RNA转变dsRNA。RdRP还是一个重要的“sensor”，它能识别正常和异常的RNA。转基因RNA和病毒RNA都是在RdRP的识别下启动RNAi的反应过程［4］。
siRNA在肝癌基因治疗中的作用
抑制癌基因表达：癌基因的过度激活和异常表达在导致细胞癌变中起重要作用。某些细胞基因被激活后异常表达，其产物为生长因子及其受体、蛋白激酶、信号转导系统及核蛋白等。这些产物可引起细胞生长和分化异常，从而发生组织癌变。siRNA可以特异地封闭这些基因的转录产物，而不影响其他基因的表达，且在体内作用更加稳定、可靠、安全。myc基因核蛋白型癌基因转录因子参与了细胞分化和恶性增殖，具有促使DNA复制的功能，可在一些致癌因素作用下(如病毒、放射性和化学诱变剂)发生基因重排和扩增而得以活化［5］。近年来，人们把siRNA技术引入到c-myc功能的研究中，通过体外合成的c-myc siRNA抑制COS1细胞内的cmyc表达活性，成功地抑制了肝癌细胞的增殖。肝癌的发生发展与HBV和HCV密切相关，采用siRNA靶向治疗HBV或HCV，对于预防肝癌的发生有重要意义。
抑制抑癌基因突变：抑癌基因突变或者表达凋亡抑制基因会导致细胞凋亡阻滞，从而引起细胞增生活跃，癌症发生。使用siRNA封闭凋亡抑制基因的表达为肿瘤治疗提供了一条新的途径。野生型p53基因可以阻止细胞进入DNA合成期，诱导细胞发生凋亡。但p53突变后致瘤性明显增强，且癌细胞具有高度侵袭性。Leirdal等［6］以p53为靶标设计合成siRNA，通过逆转录病毒为载体导入HepG2细胞株，发现细胞停滞于S期，生长受抑。
抑制细胞周期素的过度表达：肿瘤分子生物学研究显示在肿瘤发生中通常有细胞周期调控因子的突变，提示在阻止肿瘤发生发展中维持细胞周期稳定性十分重要。Li等［7］将针对cyclin E基因编码区设计siRNA转染HCC细胞，结果显示cyclin E的表达可被抑制达90%，该基因的沉默促进了HCC细胞的凋亡，阻断了其增殖。
抑制过度表达的生长因子和受体：肝细胞生长因子(HGF)是一种很强的刺激肝细胞增殖的丝裂原。HGF的单一受体c-Met是一跨膜蛋白，由原癌基因c-met编码。当细胞过度表达c-Met时，常常导致肿瘤细胞的侵袭、转移。Xie等［8］通过逆转录病毒载体介导，成功建立了长期稳定表达c-met-siRNA的肝癌细胞株MHCC97-H/c-met-siRNA，将该细胞株种植于裸小鼠体内，发现肿瘤细胞的生长受到明显抑制。
抑制凋亡抑制蛋白的过度表达：Survivin基因是迄今为止克隆出的最小凋亡抑制蛋白家族成员，可通过抑制caspase级链反应下游的caspase 3、caspase 7发挥其抗凋亡作用［9］。通过靶向survivin小片段RNA干扰后，survivin蛋白在肝癌细胞中的表达降低，肝癌细胞凋亡增加，在体内外生长均受到抑制，对化疗药物的敏感性增加，提高了肝癌治疗的整体疗效。
抑制端粒酶：端粒酶的激活使癌细胞染色体端粒维持在一定长度，一方面使细胞获得永生，另一方面使细胞周期缩短、生长变快。端粒酶中的催化亚基是决定端粒酶活性的关键因素，与恶性肿瘤的关系更为密切，其编码基因统称为hTERT。因此hTERT可作为肿瘤基因治疗的靶点。hTERT RNAi不但对肝癌细胞的生物学特征有重要影响，而且通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导，显著提高肿瘤细胞的凋亡［10］。
增强机体对化疗的耐受能力：HCC对化疗药物有高度的耐药性，通过封闭化疗抑抗基因，提高机体对化疗药物的敏感性，从而减轻化疗对机体的损伤，提高肿瘤治疗效果。多药耐药(MDR)是指肿瘤细胞对化疗药物的原发性或继发性抵抗性现象。MDR1是产生多药耐药的编码基因之一，其过度表达是引起肿瘤细胞对化疗药物产生多重耐药的原因。利用siRNA技术抑制MDR1基因表达，可使肝癌耐药株对化疗药物敏感性增强［11］。
问题及展望
目前，siRNA的研究已从体外试验过度到体内试验，为肝癌的临床治疗奠定了基础。siRNA作为即将应用于临床的新技术仍然存在许多问题。①siRNA具有高度特异性，即使单个碱基错配也会使RNAi效率降低；②并非所有的基因均可作为siRNA干扰的目标序列，非编码区的RNA是否对RNAi敏感还有待研究；③如何将siRNA安全有效地导入细胞并在其内稳定表达尚需大量的试验为临床治疗铺平道路；④siRNA在动物试验中能否特异地靶向癌组织中过度表达的蛋白基因，而不影响正常表达的同一基因；⑤由于肿瘤是多基因疾病，siRNA能否靶向多个基因而又不互相干扰；⑥siRNA对肝癌基因的封闭不完全的提高封闭率也是有待研究的。因此，siRNA技术应用于肝癌的临床治疗目前条件尚不成熟，仍需进一步研究。
参考文献
1 Christian W.Mechanisms and optimization of in vivo delivery of lipophilic siRNAs［J］.NatureBiotechnology,2007,10:1238.
2 谢淑丽,朱明光.Rhoc在肝癌细胞生长中的作用及分子机制［J］.中华肿瘤杂志,2011,33(4):270.
3 R M.Small interfering RNAs and their chemical synthesis［J］.Angew Chem Int Ed Engl,2002,41(13):2265.
4 D G.Small silencing RNAs:state-of-the-art［J］.Adv Drug Deliv Rev,2009,61(9):672.
5 王要军,谢渭芬,张忠兵.小干扰RNA在肝病中的应用进展［J］.国际外科学杂志,2006,32(2):81.
6 Leirdal M,sioud M.Gene silencing in mammalian cells by preformed smalI RNA duplexes［J］.Biochem Biophy Res Commun,2002,295(19):744.
7 Li K,Lin SY,Brunicardi FC,et al.Use of RNA interference to target cyclin E overexpressing hepacellular carcinoma［J］.Cancer Res,2003,63(13):3593.
8 Xie B,Tang DG,Dong JH,et a1.Effeccts of c-met-siRNA on the growth and invasion 0f hepatocellular carcinoma MHCC97-H cells［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi,2006,14(7):499.
9 Altieri DC.Survivin and apoptosis control［J］.Adv Cancer Res,2003,88:31.
10 Zhang RG,Fang DC,Luo YH, et al.Effects of hTERT RNAi on apoptosis of hepatocellular carcinoma cells induced by TRAIL［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi,2006,14(6):435.
11 Chen XP, Wang Q, Guan J, et al. Reversing multiding resistance by RNA interference throuugh the suppression of MDRl gene in human hepatoma cells［J］.World J Gastroenterol,2006,12(21):3332.
doi:10.3969/j.issn.1007-614x.2012.07.006
原发性肝细胞癌(PHCC)在世界范围内居常见肿瘤的第五位。近年来，随着分子生物学、免疫学、基因治疗学的发展，小干扰RNA（siRNA）以其特有的生物学特性及潜在的生物医学应用价值在PHCC治疗研究中成为热点。本文从siRNA的分子机制、原发性肝癌基因治疗原理及siRNA治疗肝癌的问题与展望几个方面做一阐述。
siRNA的背景及机制
siRNA相关背景：RNA是生物体内最重要的物质基础之一，它与DNA和蛋白质一起构成生命的框架。它可通过互补序列的结合反作用于DNA，从而关闭或调节基因的表达。甚至某些小分子RNA可以通过指导基因的开关来调控细胞的发育时钟。
RNA干涉（RNAi）现象早在1993年就有报道，1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义RNA(antisense RNA)和正义RNA(sense RNA)都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。直到1998年，Andrew Fire的研究证明，在正义RNA阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA。于是提出了RNAi这个词。目前RNAi的作用机理主要是在线虫、果蝇、斑马鱼等生物体内阐明的［1］。
siRNA发生的分子机制：siRNA发生详细机制和过程目前还不完全清楚，大致分为以下几个阶段进行。①siRNA的形成阶段：此阶段需要Rde-1、Rde-4和dsRNA特异性的核酸内切酶Dicer等共同参与。Rde-1、4编码的蛋白识别外源dsRNA，引导dsRNA与Dicer结合，然后，Dicer将dsRNA解旋，再将其裂解为21-25nt大小的siRNA。Dicer定位于胞浆中，但核内mRNA剪切修饰后在向核外运输过程中也存在RNAi现象，可能有其他类似功能的酶发挥作用。现认为21-25nt大小并在3′端带有2-3个碱基悬端且5′端磷酸化的siRNA诱导的RNAi效应最强。Dicer家族在进化上非常保守，有N-端RNA解旋酶结构域、1个PAZ结构域(PAZ)、2个RNase Ⅲ结构域和C端dsRNA结合基序5个组成部分［2］。②RNA诱导的沉默复合物(RISC)形成阶段：生成的siRNA和RNAi特异性酶如AGO-2、MUT-7、RED-1、PAZ蛋白和DNA-RNA螺旋酶结合形成RISC，具有序列特异性核酸内切酶、核酸外切酶和解旋酶活性，能特异地降解与siRNA同源的靶mRNA。③效应阶段：siRNA引导RISC与同源性的mRNA结合，在ATP及解旋酶(如qde-3、mut-6、mut-14)的作用下使siRNA链解离，并使RISC由250kD大小的前体形式变成约100kD左右活性形式，同时解旋酶催化同源mRNA与siRNA的正义链相互交换，核酸酶在mRNA与反义RNA所形成的双链区的5′起始端下游7-10个核苷酸处切断mRNA，起到特异的抑制基因表达的效果。④扩增阶段：该反应以siRNA中的一条链为引物，以靶mRNA为摸板，在RNA依赖的RNA聚合酶(RdRP)作用下，扩增靶mRNA，产生新的二级siRNA，而这些siRNA又能继续反作用于靶mRNA［3］。RdRP不仅能增加siRNA的拷贝数，而且能将异常的单链RNA转变dsRNA。RdRP还是一个重要的“sensor”，它能识别正常和异常的RNA。转基因RNA和病毒RNA都是在RdRP的识别下启动RNAi的反应过程［4］。
siRNA在肝癌基因治疗中的作用
抑制癌基因表达：癌基因的过度激活和异常表达在导致细胞癌变中起重要作用。某些细胞基因被激活后异常表达，其产物为生长因子及其受体、蛋白激酶、信号转导系统及核蛋白等。这些产物可引起细胞生长和分化异常，从而发生组织癌变。siRNA可以特异地封闭这些基因的转录产物，而不影响其他基因的表达，且在体内作用更加稳定、可靠、安全。myc基因核蛋白型癌基因转录因子参与了细胞分化和恶性增殖，具有促使DNA复制的功能，可在一些致癌因素作用下(如病毒、放射性和化学诱变剂)发生基因重排和扩增而得以活化［5］。近年来，人们把siRNA技术引入到c-myc功能的研究中，通过体外合成的c-myc siRNA抑制COS1细胞内的cmyc表达活性，成功地抑制了肝癌细胞的增殖。肝癌的发生发展与HBV和HCV密切相关，采用siRNA靶向治疗HBV或HCV，对于预防肝癌的发生有重要意义。
抑制抑癌基因突变：抑癌基因突变或者表达凋亡抑制基因会导致细胞凋亡阻滞，从而引起细胞增生活跃，癌症发生。使用siRNA封闭凋亡抑制基因的表达为肿瘤治疗提供了一条新的途径。野生型p53基因可以阻止细胞进入DNA合成期，诱导细胞发生凋亡。但p53突变后致瘤性明显增强，且癌细胞具有高度侵袭性。Leirdal等［6］以p53为靶标设计合成siRNA，通过逆转录病毒为载体导入HepG2细胞株，发现细胞停滞于S期，生长受抑。
抑制细胞周期素的过度表达：肿瘤分子生物学研究显示在肿瘤发生中通常有细胞周期调控因子的突变，提示在阻止肿瘤发生发展中维持细胞周期稳定性十分重要。Li等［7］将针对cyclin E基因编码区设计siRNA转染HCC细胞，结果显示cyclin E的表达可被抑制达90%，该基因的沉默促进了HCC细胞的凋亡，阻断了其增殖。
抑制过度表达的生长因子和受体：肝细胞生长因子(HGF)是一种很强的刺激肝细胞增殖的丝裂原。HGF的单一受体c-Met是一跨膜蛋白，由原癌基因c-met编码。当细胞过度表达c-Met时，常常导致肿瘤细胞的侵袭、转移。Xie等［8］通过逆转录病毒载体介导，成功建立了长期稳定表达c-met-siRNA的肝癌细胞株MHCC97-H/c-met-siRNA，将该细胞株种植于裸小鼠体内，发现肿瘤细胞的生长受到明显抑制。
抑制凋亡抑制蛋白的过度表达：Survivin基因是迄今为止克隆出的最小凋亡抑制蛋白家族成员，可通过抑制caspase级链反应下游的caspase 3、caspase 7发挥其抗凋亡作用［9］。通过靶向survivin小片段RNA干扰后，survivin蛋白在肝癌细胞中的表达降低，肝癌细胞凋亡增加，在体内外生长均受到抑制，对化疗药物的敏感性增加，提高了肝癌治疗的整体疗效。
抑制端粒酶：端粒酶的激活使癌细胞染色体端粒维持在一定长度，一方面使细胞获得永生，另一方面使细胞周期缩短、生长变快。端粒酶中的催化亚基是决定端粒酶活性的关键因素，与恶性肿瘤的关系更为密切，其编码基因统称为hTERT。因此hTERT可作为肿瘤基因治疗的靶点。hTERT RNAi不但对肝癌细胞的生物学特征有重要影响，而且通过肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(TRAIL)诱导，显著提高肿瘤细胞的凋亡［10］。
增强机体对化疗的耐受能力：HCC对化疗药物有高度的耐药性，通过封闭化疗抑抗基因，提高机体对化疗药物的敏感性，从而减轻化疗对机体的损伤，提高肿瘤治疗效果。多药耐药(MDR)是指肿瘤细胞对化疗药物的原发性或继发性抵抗性现象。MDR1是产生多药耐药的编码基因之一，其过度表达是引起肿瘤细胞对化疗药物产生多重耐药的原因。利用siRNA技术抑制MDR1基因表达，可使肝癌耐药株对化疗药物敏感性增强［11］。
问题及展望
目前，siRNA的研究已从体外试验过度到体内试验，为肝癌的临床治疗奠定了基础。siRNA作为即将应用于临床的新技术仍然存在许多问题。①siRNA具有高度特异性，即使单个碱基错配也会使RNAi效率降低；②并非所有的基因均可作为siRNA干扰的目标序列，非编码区的RNA是否对RNAi敏感还有待研究；③如何将siRNA安全有效地导入细胞并在其内稳定表达尚需大量的试验为临床治疗铺平道路；④siRNA在动物试验中能否特异地靶向癌组织中过度表达的蛋白基因，而不影响正常表达的同一基因；⑤由于肿瘤是多基因疾病，siRNA能否靶向多个基因而又不互相干扰；⑥siRNA对肝癌基因的封闭不完全的提高封闭率也是有待研究的。因此，siRNA技术应用于肝癌的临床治疗目前条件尚不成熟，仍需进一步研究。
参考文献
1 Christian W.Mechanisms and optimization of in vivo delivery of lipophilic siRNAs［J］.NatureBiotechnology,2007,10:1238.
2 谢淑丽,朱明光.Rhoc在肝癌细胞生长中的作用及分子机制［J］.中华肿瘤杂志,2011,33(4):270.
3 R M.Small interfering RNAs and their chemical synthesis［J］.Angew Chem Int Ed Engl,2002,41(13):2265.
4 D G.Small silencing RNAs:state-of-the-art［J］.Adv Drug Deliv Rev,2009,61(9):672.
5 王要军,谢渭芬,张忠兵.小干扰RNA在肝病中的应用进展［J］.国际外科学杂志,2006,32(2):81.
6 Leirdal M,sioud M.Gene silencing in mammalian cells by preformed smalI RNA duplexes［J］.Biochem Biophy Res Commun,2002,295(19):744.
7 Li K,Lin SY,Brunicardi FC,et al.Use of RNA interference to target cyclin E overexpressing hepacellular carcinoma［J］.Cancer Res,2003,63(13):3593.
8 Xie B,Tang DG,Dong JH,et a1.Effeccts of c-met-siRNA on the growth and invasion 0f hepatocellular carcinoma MHCC97-H cells［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi,2006,14(7):499.
9 Altieri DC.Survivin and apoptosis control［J］.Adv Cancer Res,2003,88:31.
10 Zhang RG,Fang DC,Luo YH, et al.Effects of hTERT RNAi on apoptosis of hepatocellular carcinoma cells induced by TRAIL［J］.Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi,2006,14(6):435.
11 Chen XP, Wang Q, Guan J, et al. Reversing multiding resistance by RNA interference throuugh the suppression of MDRl gene in human hepatoma cells［J］.World J Gastroenterol,2006,12(21):3332.