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摘 要 橡膠树转基因过程筛选效率低阻碍了转基因研究快速发展。花青素累积产生的紫红色肉眼直接可辨，是一种简单、安全的可视化筛选标记。为利用橡胶树花青素作为转基因筛选标记，本文首先以R2R3-MYB保守结构域（R2、R3）为探针调取橡胶树R2R3-MYB，并与拟南芥等其他物种花青素合成相关的R2R3-MYB进行进化分析，结果显示橡胶树scaffold0374_923317和Scaffold0598_393375与其他物种已功能验证的花青素合成调控R2R3-MYB聚到同一亚类。随后从古铜期叶片中克隆到scaffold0374_923317基因，并将其命名为HbAn1。序列分析表明，HbAn1蛋白具有R2R3-MYB蛋白的典型结构：R2R3结构域及bHLH互作结构域。定量表达分析表明HbAn1在古铜期叶片及暗培养茎秆中高水平表达，在其他时期叶片及光照培养茎秆中表达水平很低，与不同组织花青素含量正相关。最后，在烟草中组成型过表达HbAn1，使烟草叶片、花瓣、花托、花丝等组织大量累积花青素，定量分析表明其激活了这些组织后期花青素合成酶基因NtDFR， NtLDOX， NtUFGT。本文首次获得橡胶树花青素累积相关的正调控因子R2R3-MYB（HbAn1），这为花青素作为橡胶树转基因可视化筛选标记提供了基因资源。
关键词 橡胶树；花青素；可视化筛选标记；R2R3-MYB；结构域
中图分类号 S432.1 文献标识码 A
Abstract The low screening efficiency for the positive embryo of rubber trees hinders the development of transgenic research in Hevea. Red purple from anthocyanin， which can be detected by naked eyes， is a simple and safe visual marker. In order to take anthocyanin as the selective marker to improve the screening efficiency for the positive embryo of rubber trees， R2R3-MYB of rubber trees was cloned based on the conserved domain of R2R3-MYB， and the phylogenetic relationship with the anthocyanin-related R2R3-MYB of Arabidopsis thaliana and other species was analyzed， Results showed that scaffold 0374_923317 and Scaffold 0598_393375 were classified in the same sub-group with other known anthocyanin-related R2R3-MYB regulators. Then scaffold0374_923317 isolated from the bronze leaf， and named as HbAn1， had the typical conserved R2R3 and bHLH interaction domain. Quantitative expression analysis revealed that the expression of HbAn1 decreased gradually with the development of rubber leaves， which was coincided with the anthocyanin accumulation contents of rubber leaves. The expression of HbAn1 was also coincided with green and red stems， indicating that the expression of HbAn1 was positively correlated with rubber tree anthocyanin accumulation. Finally， in constitutive overexpression HbAn1 tobacco， the anthocyanin accumulation increased extremely in tobacco leaves， petals， filaments and receptacles caused by activating the late flavonoid pathway genes NtDFR， NtLDOX， NtUFGT. In this paper， for the first time， R2R3-MYB positively regulating anthocyanin accumulation in H. brasiliensis was isolated， which would provide a gene resource for the visual selection marker of H. brasiliensis transformation.
Key words Hevea brasiliensis； anthocyanin； visual selection marker； R2R3-MYB； domain
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.015 1994年，马来西亚的Arokiaraj等[1]使用基因枪法转化橡胶树花药愈伤组织，在世界上首次获得2株橡胶树转基因植株。随后，Jayashree等[2]、Leclercq等[3]、Sunderasan等[4]通过根癌农杆菌介导法分别将功能基因橡胶树超氧化物歧化酶基因（HbSOD）、铜锌超氧化物歧化酶基因（HbCuZnSOD）和人心钠素基因（HANF）导入橡胶树。我国黄天带等[5]通过农杆菌介导花药愈伤组织获得11株转基因橡胶树，随后，Huang等[6]以次生胚为侵染受体，转化效率提高到4.06%。
然而，到目前为止，橡胶树均以nptII为筛选标记，gus或gfp为报告基因，筛选效率低、准确性差。以50 mg/L卡那霉素作为选择压，抗性胚状体GUS阳性率仅为1.9%[6]；以100 mg/L巴龙霉素作为选择压，抗性愈伤GUS阳性率仅为17.9%[7]；将卡那霉素浓度提高到300 mg/L，抗性愈伤GUS阳性率也仅为4%[2]。Leclercq等[8]试图利用gfp在早期筛选出阳性愈伤组织，提高筛选效率，然而，24块GFP阳性愈伤团经过7次继代增殖及巴龙霉素筛选后，累计为7 510个愈伤团，最终仅筛选出12个阳性愈伤系（0.2%），因此，由于GFP检测需要依赖特殊仪器，且荧光淬灭快，未能提高筛选效率及准确率。而GUS需要添加昂贵底物，且为破坏性检测，不能实现活体实时监测。
花青素是一种肉眼直接可辨、简单、安全的筛选标记，通常呈红色或紫红色，作为可视化筛选标记，已成功应用于玉米、烟草、西红柿、苹果、葡萄转基因研究[9-13]及病毒侵染示踪[14]、硼元素缺乏实时监测[15]，无需专用设备或化学试剂，对材料无破坏性。
橡胶树古铜期叶片以及暗培养的幼嫩植株茎秆均为紫红色，同时，橡胶树胚状体受茉莉酸诱导时从白色变为紫红色，这些组织的颜色均由花青素——矢车菊素累积造成[16-18]。植物花青素合成主要由R2R3-MYB、bHLH和WD40三类转录因子构成MBW（MYB-bHLH-WD40）复合体调控[19-20]，其中R2R3-MYB直接激活结构基因的表达[21-22]，是调控花青素合成的关键因子，其具有2个高度保守的、可结合DNA的MYB结构域（R2、R3结构域），且R3结构域内通常含有一个与bHLH互作的[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R基序[23]。
本研究利用植物花青素合成R2R3-MYB调控基因功能和结构保守性，首先通过生物信息学调取橡胶树花青素合成相关的R2R3-MYB，随后，克隆了橡胶树花青素合成相关的R2R3-MYB（HbAn1），并通过组织定量表达分析和烟草过表达证明其正调控花青素合成，为利用花青素作为橡胶树遗传转化可视化筛选标记提供候选基因。
1 材料与方法
1.1 材料
巴西橡胶树热研7-33-97古铜期、淡绿期、变色期、稳定期等4个发育时期的叶片以及黑暗和光照培养下幼苗嫩茎，作为橡胶树花青素合成调控基因克隆及其表达分析的研究材料。
1.2 方法
1.2.1 利用生物信息学筛选橡胶树花青素合成R2R3-MYB蛋白 以R2R3-MYB保守结构域（R2、R3）为探针，从橡胶树基因组数据库中调取R2R3-MYB转录因子，随后，从NCBI中调取拟南芥等植物已验证功能的控制花青素合成的R2R3-MYB，利用clustal omega（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）进行蛋白系统进化分析，筛选与已验证功能的花青素合成调控基因在同一进化分支的橡胶树R2R3-MYB。
1.2.2 克隆與橡胶树花青素合成调控相关R2R3-MYB蛋白基因 依据系统进化分析结果，调取与已验证功能的其他物种花青素合成调控基因在同一进化分支的橡胶树R2R3-MYB蛋白的cDNA序列，设计特异扩增引物（正向引物：5′ GGCTAGCTTCA
TCATATATGGAAGGC，反向引物：GGTGGTGTAA
AGCTTAAAACATCTCATCG），以古铜期叶片cDNA为模板，用Takara的Primer STAR MAX进行PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳检测正确后，用OMEGA公司的Gel Extraction kit（100）凝胶回收试剂盒进行目的片段回收测序。
1.2.3 HbAn1在橡胶树不同花青素含量组织表达分析 以古铜期、变色期、淡绿期和稳定期等4个发育时期叶片、暗培养和光培养体胚植株嫩茎cDNA为模板，Premix Ex Taq为反应酶，荧光定量PCR反应在Light Cycler @2.0荧光定量PCR仪中进行（Roche公司）。荧光定量引物见表1。反应程序为95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min。反应体系为10 μL，其中5 μL 2×Premix Ex Taq，0.25 μL引物（10 μmoL），0.5 μL cDNA模板。反应结果使用Light Cycler Software 4.05软件进行分析。以RH8作为内参基因，标准品cDNA和待测样品均设置3次重复。
1.2.4 HbAn1在烟草中过表达分析 将HbAn1克隆到pCAMBIA2301中，以CaMv35S作为启动子，Nos作为终止子，然后，转化到GV3101中用于侵染烟草，侵染方法及培养基参照Pattanaik等[24]。待紫红色抗性芽长至2 cm左右大小时，剪下，转入筛选生根培养基中，诱导其生根，生根后再移栽到温室。
以转基因烟草叶片、花瓣等组织的cDNA为模板，通过荧光定量PCR，对烟草花青素合成调控基因NtAn1（bHLH）和NtAn2（MYB）及结构基因进行表达分析，确定橡胶树转录因子的表达对烟草花青素合成基因调控作用，除了退火温度外，反应条件及反应体系与1.2.3相同，以烟草NtTub基因为内参。引物序列见表1。 1.3 数据分析
荧光定量结果采用2-ΔΔCT方法分析，用SAS软件（V9.0）进行显著性分析，α=0.05。
2 结果与分析
2.1 控制橡胶树花青素合成R2R3-MYB生物信息学分析结果
对橡胶树全基因组扫描R2R3-MYB，共获得177个R2R3-MYB，然后，从NCBI下载拟南芥AtPAP2（AT1G66390.1）、矮牵牛PhAN2（AB982128.1）、烟草NtAN2（FJ472647.1）、金鱼草AmROSEA1（DQ275529.1）、金鱼草AmROSEA2（DQ275530.1）、金鱼草AmVENOSA（DQ275531.1）、苹果MdMYB10（DQ267896.1）、马铃薯StAN1（AY841127.1）、葡萄VvMYBA1（AB097923.1）、葡萄VvMYBA2（AB097924.1）等10个花青素合成相关R2R3-MYB，进化分析发现，橡胶树scaffold0374_
923317和Scaffold0598_393375与已鉴定的花青素合成相关转录调控因子在同一进化分支（图1），推测两者与橡胶树花青素合成调控可能相关，后续分析以两者为目标基因展开。
2.2 与橡胶树花青素合成调控相关R2R3-MYB克隆及结构域分析结果
从橡胶树基因组数据库中调取scaffold0374_
923317和Scaffold0598_393375序列，并以此序列为检索序列，对作者单位叶片转录组数据进行检索，调取其基因序列，随后，设计特异扩增PCR引物进行扩增，结果获得与scaffold0374_923317相同的基因序列，测序后其全长为618 bp（图2），将其命名为HbAn1。Scaffold0598_393375未扩增到，推测可能该Scaffold为拼接序列。
与拟南芥AtPAP2（AT1G66390.1）、矮牵牛PhAN2（AB982128.1）、烟草NtAN2（FJ472647.1）、金鱼草AmROSEA1（DQ275529.1）、金鱼草AmROSEA2（DQ275530.1）、金鱼草AmVENOSA（DQ275531.1）、苹果MdMYB10（DQ267896.1）、马铃薯StAn1（AY841127.1）、葡萄VvMYBA1（AB097923.1）、葡萄VvMYBA2（AB097924.1）等10个花青素合成相关R2R3-MYB蛋白序列比对发现，HbAn1蛋白不但具有R2R3-MYB两个保守结构域，同时，在R3结构域中具有与bHLH互作结构域（D/E）LX2（R-K）X3LX6LX3R，此结构域是花青素合成MYB调控因子的特征结构域，预示着HbAn1可能是调控橡胶树花青素合成关键调控因子。
2.3 HbAn1在不同花青素含量组织中表达分析结果
以古铜期、变色期、淡绿期和稳定期等4个时期叶片及暗培养和光照培养嫩茎为材料，进行HbAn1荧光定量PCR分析发现，HbAn1随着叶片老化及花青素逐渐褪去，其表达量逐渐下降，同时，暗培养嫩茎中HbAn1表达要高于光照培养嫩茎（图3），这与花青素含量正相关，预示着HbAn1与橡胶树花青素累积可能具有相关性。
2.4 HbAn1在烟草中过表达分析结果
通过农杆菌介导的烟草叶片转化，共获得11个转化植株，本研究挑取3个转化植株进行了后续研究。在发育早期，叶片花青素累积随着植株长大，花青素逐渐褪去，如在植株分化阶段以及生根早期，叶片累积大量花青素，而随着植株叶片增多，新抽出的葉片花青素累积量变少（图4-A～C）。在植株长大后，其叶片、花瓣、花托、花丝均较非转基因的植株大量累积花青素（图4-D～F），但是，叶片累积花青素明显低于花瓣、花托和花丝。
为了检测HbAn1过表达对烟草内源结构基因表达影响，对叶片、花瓣、花托和花丝等4个组织表达分析发现，在这4个组织中内源花青素合成结构基因均上调表达，尤其是3个后期结构基因NtDFR、NtANS和NtUFGT表达量极显著上调（图5）。对于内源花青素合成调控因子，在不同组织中表达模式与结构基因有所不同，在花瓣中NtAn1（bHLH）和NtAn2（MYB） 有所下调，在花托和花丝中NtAn1和NtAn2或NtAn2被上调，然而，在叶片中NtAn1和NtAn2并没有发生显著改变（图6）。
3 讨论
3.1 获得橡胶树花青素合成R2R3-MYB基因HbAn1，为橡胶树遗传转化可视化筛选标记提供候选基因
以往研究发现R2R3-MYB蛋白异源表达后，受体物种不累积花青素或累积组织存在差异[25，29]，主要原因如下：（1）外源调控因子与受体物种调控因子不能互作[25]；（2）无法识别、激活受体花青素结构基因启动子[22]；（3）转录因子的表达具有组织特异性[26-27]；（4）受体物种/组织没有花青素合成调控因子或/和结构基因[28]。但植物自身的花青素合成调控基因能激活自身花青素累积[12，26，29]。综上所述，利用外源MYB基因转化橡胶树其表型难以预期，而物种自身转录因子过表达则能有效提高该物种花青素累积量，因此需要克隆橡胶树自身MYB基因。据我们所知，橡胶树中未见花青素合成相关R2R3-MYB基因克隆报道。
本文获得了1个R2R3-MYB基因，其具有R2R3-MYB蛋白的典型特征：含R2、R3保守结构域，且R3结构域具有与bHLH蛋白互作结构域（图2），其表达模式与橡胶树花青素累积正相关（图3），其通过与烟草内源花青素合成调控因子互作（图5）且/或促进烟草花青素合成结构基因尤其是后期基因表达量提高（图6）正调控烟草花青素合成（图4），以上证据表明本研究克隆到了橡胶树正调控花青素合成R2R3-MYB基因，我们将其命名为HbAn1，为橡胶树遗传转化可视化筛选标记提供候选基因。 3.2 HbAn1可以作为烟草转基因可视化筛选标记
由于其高再生能力，烟草常作为植物基因功能验证的模式植物，为了在大量的非转化细胞中筛选出阳性转化子，通常通过抗生素加gus基因的方式。筛选步骤繁琐、准确率低。
花青素肉眼可见，将其作为遗传转化报告基因可实现实时活体监测，但是其过量表达影响植物生长甚至致死[13]，是其作为可视化筛选标记的最大障碍。过表达HbAn1烟草，新生小苗叶片为紫红色（图4-A、B），随着植株长大，抽出的新叶为正常绿色（图4-C）。植株进入生殖生长后，其花器官（花瓣、花丝、花托）大量累积花青素（图5-B、C），但是不影响转基因植株正常结实，种子正常萌发（数据未提供）。由此可见，HbAn1可通过紫红色叶片在烟草转基因早期筛选出阳性芽，并可在花器官形成时进一步确认转化事件，而不影响转基因植株的营养生长、结实及种子萌发。因此，HbAn1在烟草中的表达模式使其可直接作为烟草转化的可视化筛选标记。
3.3 HbAn1作为橡胶树转基因可视化筛选标记
橡胶树遗传转化以nptII作为筛选标记，以gus和gfp作为报告基因[2-8]，或假阳性率高，或需要添加昂贵底物且破坏受检材料，或需要特殊仪器且受本底荧光干扰。因此需要开发无需添加底物、对材料无破坏性、无需特殊设备的新型可视化筛选标记以实现精准筛选。
本研究克隆了橡胶树花青素合成R2R3-MYB正调控因子HbAn1，其能否作为可视化筛选标记基因应用于橡胶树遗传转化研究的关键是受检组织是否存在花青素合成途径。橡胶树遗传转化均依赖体胚再生体系，抗性胚是重要的筛选对象[2-6，8]。前期研究表明橡胶树胚状体存在花青素合成的完整途径，且能被茉莉酸调控[17-18]，因此可进一步推断过表达HbAn1可激活胚状体花青素合成结构基因表达，从而促进胚状体累积花青素，使胚状体从白色变成紫红色，实现肉眼识别转化子。
花青素作为遗传转化筛选标记的最大问题是其过量表达影响植株再生及生长[13]。因此，筛选表达量适宜的组织特异型启动子使花青素仅在子叶累积，从而实现活体筛选但不影响植株正常生长发育，是花青素能否作为可视化筛选标记应用于橡胶树转基因研究需要解决的问题。
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Abstract The low screening efficiency for the positive embryo of rubber trees hinders the development of transgenic research in Hevea. Red purple from anthocyanin， which can be detected by naked eyes， is a simple and safe visual marker. In order to take anthocyanin as the selective marker to improve the screening efficiency for the positive embryo of rubber trees， R2R3-MYB of rubber trees was cloned based on the conserved domain of R2R3-MYB， and the phylogenetic relationship with the anthocyanin-related R2R3-MYB of Arabidopsis thaliana and other species was analyzed， Results showed that scaffold 0374_923317 and Scaffold 0598_393375 were classified in the same sub-group with other known anthocyanin-related R2R3-MYB regulators. Then scaffold0374_923317 isolated from the bronze leaf， and named as HbAn1， had the typical conserved R2R3 and bHLH interaction domain. Quantitative expression analysis revealed that the expression of HbAn1 decreased gradually with the development of rubber leaves， which was coincided with the anthocyanin accumulation contents of rubber leaves. The expression of HbAn1 was also coincided with green and red stems， indicating that the expression of HbAn1 was positively correlated with rubber tree anthocyanin accumulation. Finally， in constitutive overexpression HbAn1 tobacco， the anthocyanin accumulation increased extremely in tobacco leaves， petals， filaments and receptacles caused by activating the late flavonoid pathway genes NtDFR， NtLDOX， NtUFGT. In this paper， for the first time， R2R3-MYB positively regulating anthocyanin accumulation in H. brasiliensis was isolated， which would provide a gene resource for the visual selection marker of H. brasiliensis transformation.
Key words Hevea brasiliensis； anthocyanin； visual selection marker； R2R3-MYB； domain
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2017.12.015 1994年，马来西亚的Arokiaraj等[1]使用基因枪法转化橡胶树花药愈伤组织，在世界上首次获得2株橡胶树转基因植株。随后，Jayashree等[2]、Leclercq等[3]、Sunderasan等[4]通过根癌农杆菌介导法分别将功能基因橡胶树超氧化物歧化酶基因（HbSOD）、铜锌超氧化物歧化酶基因（HbCuZnSOD）和人心钠素基因（HANF）导入橡胶树。我国黄天带等[5]通过农杆菌介导花药愈伤组织获得11株转基因橡胶树，随后，Huang等[6]以次生胚为侵染受体，转化效率提高到4.06%。
然而，到目前为止，橡胶树均以nptII为筛选标记，gus或gfp为报告基因，筛选效率低、准确性差。以50 mg/L卡那霉素作为选择压，抗性胚状体GUS阳性率仅为1.9%[6]；以100 mg/L巴龙霉素作为选择压，抗性愈伤GUS阳性率仅为17.9%[7]；将卡那霉素浓度提高到300 mg/L，抗性愈伤GUS阳性率也仅为4%[2]。Leclercq等[8]试图利用gfp在早期筛选出阳性愈伤组织，提高筛选效率，然而，24块GFP阳性愈伤团经过7次继代增殖及巴龙霉素筛选后，累计为7 510个愈伤团，最终仅筛选出12个阳性愈伤系（0.2%），因此，由于GFP检测需要依赖特殊仪器，且荧光淬灭快，未能提高筛选效率及准确率。而GUS需要添加昂贵底物，且为破坏性检测，不能实现活体实时监测。
花青素是一种肉眼直接可辨、简单、安全的筛选标记，通常呈红色或紫红色，作为可视化筛选标记，已成功应用于玉米、烟草、西红柿、苹果、葡萄转基因研究[9-13]及病毒侵染示踪[14]、硼元素缺乏实时监测[15]，无需专用设备或化学试剂，对材料无破坏性。
橡胶树古铜期叶片以及暗培养的幼嫩植株茎秆均为紫红色，同时，橡胶树胚状体受茉莉酸诱导时从白色变为紫红色，这些组织的颜色均由花青素——矢车菊素累积造成[16-18]。植物花青素合成主要由R2R3-MYB、bHLH和WD40三类转录因子构成MBW（MYB-bHLH-WD40）复合体调控[19-20]，其中R2R3-MYB直接激活结构基因的表达[21-22]，是调控花青素合成的关键因子，其具有2个高度保守的、可结合DNA的MYB结构域（R2、R3结构域），且R3结构域内通常含有一个与bHLH互作的[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R基序[23]。
本研究利用植物花青素合成R2R3-MYB调控基因功能和结构保守性，首先通过生物信息学调取橡胶树花青素合成相关的R2R3-MYB，随后，克隆了橡胶树花青素合成相关的R2R3-MYB（HbAn1），并通过组织定量表达分析和烟草过表达证明其正调控花青素合成，为利用花青素作为橡胶树遗传转化可视化筛选标记提供候选基因。
1 材料与方法
1.1 材料
巴西橡胶树热研7-33-97古铜期、淡绿期、变色期、稳定期等4个发育时期的叶片以及黑暗和光照培养下幼苗嫩茎，作为橡胶树花青素合成调控基因克隆及其表达分析的研究材料。
1.2 方法
1.2.1 利用生物信息学筛选橡胶树花青素合成R2R3-MYB蛋白 以R2R3-MYB保守结构域（R2、R3）为探针，从橡胶树基因组数据库中调取R2R3-MYB转录因子，随后，从NCBI中调取拟南芥等植物已验证功能的控制花青素合成的R2R3-MYB，利用clustal omega（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）进行蛋白系统进化分析，筛选与已验证功能的花青素合成调控基因在同一进化分支的橡胶树R2R3-MYB。
1.2.2 克隆與橡胶树花青素合成调控相关R2R3-MYB蛋白基因 依据系统进化分析结果，调取与已验证功能的其他物种花青素合成调控基因在同一进化分支的橡胶树R2R3-MYB蛋白的cDNA序列，设计特异扩增引物（正向引物：5′ GGCTAGCTTCA
TCATATATGGAAGGC，反向引物：GGTGGTGTAA
AGCTTAAAACATCTCATCG），以古铜期叶片cDNA为模板，用Takara的Primer STAR MAX进行PCR扩增，2%琼脂糖凝胶电泳检测正确后，用OMEGA公司的Gel Extraction kit（100）凝胶回收试剂盒进行目的片段回收测序。
1.2.3 HbAn1在橡胶树不同花青素含量组织表达分析 以古铜期、变色期、淡绿期和稳定期等4个发育时期叶片、暗培养和光培养体胚植株嫩茎cDNA为模板，Premix Ex Taq为反应酶，荧光定量PCR反应在Light Cycler @2.0荧光定量PCR仪中进行（Roche公司）。荧光定量引物见表1。反应程序为95 ℃ 1 min，95 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，72 ℃ 1 min。反应体系为10 μL，其中5 μL 2×Premix Ex Taq，0.25 μL引物（10 μmoL），0.5 μL cDNA模板。反应结果使用Light Cycler Software 4.05软件进行分析。以RH8作为内参基因，标准品cDNA和待测样品均设置3次重复。
1.2.4 HbAn1在烟草中过表达分析 将HbAn1克隆到pCAMBIA2301中，以CaMv35S作为启动子，Nos作为终止子，然后，转化到GV3101中用于侵染烟草，侵染方法及培养基参照Pattanaik等[24]。待紫红色抗性芽长至2 cm左右大小时，剪下，转入筛选生根培养基中，诱导其生根，生根后再移栽到温室。
以转基因烟草叶片、花瓣等组织的cDNA为模板，通过荧光定量PCR，对烟草花青素合成调控基因NtAn1（bHLH）和NtAn2（MYB）及结构基因进行表达分析，确定橡胶树转录因子的表达对烟草花青素合成基因调控作用，除了退火温度外，反应条件及反应体系与1.2.3相同，以烟草NtTub基因为内参。引物序列见表1。 1.3 数据分析
荧光定量结果采用2-ΔΔCT方法分析，用SAS软件（V9.0）进行显著性分析，α=0.05。
2 结果与分析
2.1 控制橡胶树花青素合成R2R3-MYB生物信息学分析结果
对橡胶树全基因组扫描R2R3-MYB，共获得177个R2R3-MYB，然后，从NCBI下载拟南芥AtPAP2（AT1G66390.1）、矮牵牛PhAN2（AB982128.1）、烟草NtAN2（FJ472647.1）、金鱼草AmROSEA1（DQ275529.1）、金鱼草AmROSEA2（DQ275530.1）、金鱼草AmVENOSA（DQ275531.1）、苹果MdMYB10（DQ267896.1）、马铃薯StAN1（AY841127.1）、葡萄VvMYBA1（AB097923.1）、葡萄VvMYBA2（AB097924.1）等10个花青素合成相关R2R3-MYB，进化分析发现，橡胶树scaffold0374_
923317和Scaffold0598_393375与已鉴定的花青素合成相关转录调控因子在同一进化分支（图1），推测两者与橡胶树花青素合成调控可能相关，后续分析以两者为目标基因展开。
2.2 与橡胶树花青素合成调控相关R2R3-MYB克隆及结构域分析结果
从橡胶树基因组数据库中调取scaffold0374_
923317和Scaffold0598_393375序列，并以此序列为检索序列，对作者单位叶片转录组数据进行检索，调取其基因序列，随后，设计特异扩增PCR引物进行扩增，结果获得与scaffold0374_923317相同的基因序列，测序后其全长为618 bp（图2），将其命名为HbAn1。Scaffold0598_393375未扩增到，推测可能该Scaffold为拼接序列。
与拟南芥AtPAP2（AT1G66390.1）、矮牵牛PhAN2（AB982128.1）、烟草NtAN2（FJ472647.1）、金鱼草AmROSEA1（DQ275529.1）、金鱼草AmROSEA2（DQ275530.1）、金鱼草AmVENOSA（DQ275531.1）、苹果MdMYB10（DQ267896.1）、马铃薯StAn1（AY841127.1）、葡萄VvMYBA1（AB097923.1）、葡萄VvMYBA2（AB097924.1）等10个花青素合成相关R2R3-MYB蛋白序列比对发现，HbAn1蛋白不但具有R2R3-MYB两个保守结构域，同时，在R3结构域中具有与bHLH互作结构域（D/E）LX2（R-K）X3LX6LX3R，此结构域是花青素合成MYB调控因子的特征结构域，预示着HbAn1可能是调控橡胶树花青素合成关键调控因子。
2.3 HbAn1在不同花青素含量组织中表达分析结果
以古铜期、变色期、淡绿期和稳定期等4个时期叶片及暗培养和光照培养嫩茎为材料，进行HbAn1荧光定量PCR分析发现，HbAn1随着叶片老化及花青素逐渐褪去，其表达量逐渐下降，同时，暗培养嫩茎中HbAn1表达要高于光照培养嫩茎（图3），这与花青素含量正相关，预示着HbAn1与橡胶树花青素累积可能具有相关性。
2.4 HbAn1在烟草中过表达分析结果
通过农杆菌介导的烟草叶片转化，共获得11个转化植株，本研究挑取3个转化植株进行了后续研究。在发育早期，叶片花青素累积随着植株长大，花青素逐渐褪去，如在植株分化阶段以及生根早期，叶片累积大量花青素，而随着植株叶片增多，新抽出的葉片花青素累积量变少（图4-A～C）。在植株长大后，其叶片、花瓣、花托、花丝均较非转基因的植株大量累积花青素（图4-D～F），但是，叶片累积花青素明显低于花瓣、花托和花丝。
为了检测HbAn1过表达对烟草内源结构基因表达影响，对叶片、花瓣、花托和花丝等4个组织表达分析发现，在这4个组织中内源花青素合成结构基因均上调表达，尤其是3个后期结构基因NtDFR、NtANS和NtUFGT表达量极显著上调（图5）。对于内源花青素合成调控因子，在不同组织中表达模式与结构基因有所不同，在花瓣中NtAn1（bHLH）和NtAn2（MYB） 有所下调，在花托和花丝中NtAn1和NtAn2或NtAn2被上调，然而，在叶片中NtAn1和NtAn2并没有发生显著改变（图6）。
3 讨论
3.1 获得橡胶树花青素合成R2R3-MYB基因HbAn1，为橡胶树遗传转化可视化筛选标记提供候选基因
以往研究发现R2R3-MYB蛋白异源表达后，受体物种不累积花青素或累积组织存在差异[25，29]，主要原因如下：（1）外源调控因子与受体物种调控因子不能互作[25]；（2）无法识别、激活受体花青素结构基因启动子[22]；（3）转录因子的表达具有组织特异性[26-27]；（4）受体物种/组织没有花青素合成调控因子或/和结构基因[28]。但植物自身的花青素合成调控基因能激活自身花青素累积[12，26，29]。综上所述，利用外源MYB基因转化橡胶树其表型难以预期，而物种自身转录因子过表达则能有效提高该物种花青素累积量，因此需要克隆橡胶树自身MYB基因。据我们所知，橡胶树中未见花青素合成相关R2R3-MYB基因克隆报道。
本文获得了1个R2R3-MYB基因，其具有R2R3-MYB蛋白的典型特征：含R2、R3保守结构域，且R3结构域具有与bHLH蛋白互作结构域（图2），其表达模式与橡胶树花青素累积正相关（图3），其通过与烟草内源花青素合成调控因子互作（图5）且/或促进烟草花青素合成结构基因尤其是后期基因表达量提高（图6）正调控烟草花青素合成（图4），以上证据表明本研究克隆到了橡胶树正调控花青素合成R2R3-MYB基因，我们将其命名为HbAn1，为橡胶树遗传转化可视化筛选标记提供候选基因。 3.2 HbAn1可以作为烟草转基因可视化筛选标记
由于其高再生能力，烟草常作为植物基因功能验证的模式植物，为了在大量的非转化细胞中筛选出阳性转化子，通常通过抗生素加gus基因的方式。筛选步骤繁琐、准确率低。
花青素肉眼可见，将其作为遗传转化报告基因可实现实时活体监测，但是其过量表达影响植物生长甚至致死[13]，是其作为可视化筛选标记的最大障碍。过表达HbAn1烟草，新生小苗叶片为紫红色（图4-A、B），随着植株长大，抽出的新叶为正常绿色（图4-C）。植株进入生殖生长后，其花器官（花瓣、花丝、花托）大量累积花青素（图5-B、C），但是不影响转基因植株正常结实，种子正常萌发（数据未提供）。由此可见，HbAn1可通过紫红色叶片在烟草转基因早期筛选出阳性芽，并可在花器官形成时进一步确认转化事件，而不影响转基因植株的营养生长、结实及种子萌发。因此，HbAn1在烟草中的表达模式使其可直接作为烟草转化的可视化筛选标记。
3.3 HbAn1作为橡胶树转基因可视化筛选标记
橡胶树遗传转化以nptII作为筛选标记，以gus和gfp作为报告基因[2-8]，或假阳性率高，或需要添加昂贵底物且破坏受检材料，或需要特殊仪器且受本底荧光干扰。因此需要开发无需添加底物、对材料无破坏性、无需特殊设备的新型可视化筛选标记以实现精准筛选。
本研究克隆了橡胶树花青素合成R2R3-MYB正调控因子HbAn1，其能否作为可视化筛选标记基因应用于橡胶树遗传转化研究的关键是受检组织是否存在花青素合成途径。橡胶树遗传转化均依赖体胚再生体系，抗性胚是重要的筛选对象[2-6，8]。前期研究表明橡胶树胚状体存在花青素合成的完整途径，且能被茉莉酸调控[17-18]，因此可进一步推断过表达HbAn1可激活胚状体花青素合成结构基因表达，从而促进胚状体累积花青素，使胚状体从白色变成紫红色，实现肉眼识别转化子。
花青素作为遗传转化筛选标记的最大问题是其过量表达影响植株再生及生长[13]。因此，筛选表达量适宜的组织特异型启动子使花青素仅在子叶累积，从而实现活体筛选但不影响植株正常生长发育，是花青素能否作为可视化筛选标记应用于橡胶树转基因研究需要解决的问题。
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