观察碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、肝细胞生长因子(HGF)、血管内皮生长因子C(VEGF-C)在骨髓间充质干细胞(BMSC)向淋巴管内皮细胞(LEC)分化中的作用。
方法取第3～5代大鼠BMSC进行实验。(1)取大鼠BMSC，采用随机数字表法(分组方法下同)分为阴性对照组、CD90组、CD44组、CD34组，每组样本数为3，阴性对照组细胞加入磷酸盐缓冲液5 μL，余3组细胞分别加入相应抗体5 μL，流式细胞仪检测细胞表面抗原阳性情况。(2)取3个批次大鼠BMSC，均分为空白对照组、VEGF-C组、HGF组、bFGF组、VEGF-C＋HGF组、VEGF-C＋bFGF组、HGF＋bFGF组、VEGF-C＋HGF＋bFGF组，每组样本数为3。空白对照组细胞加入2 mL完全培养基，VEGF-C组细胞中加入2 mL完全培养基和10 μg/mL VEGF-C 10 μL，HGF组细胞加入2 mL完全培养基和10 μg/mL HGF 16 μL，bFGF组细胞加入2 mL完全培养基和1 μg/mL bFGF 20 μL，VEGF-C＋HGF组、VEGF-C＋bFGF组、HGF＋bFGF组、VEGF-C＋HGF＋bFGF组细胞加入2 mL完全培养基及同前相应浓度和量的诱导因子。培养10 d，倒置相差显微镜下观察细胞形态，蛋白质印迹法和实时荧光定量反转录PCR法分别检测淋巴管内皮透明质酸受体1(LYVE-1)、VEGF受体3(VEGFR3)及整合素α9蛋白和mRNA表达。(3)取大鼠BMSC，分为空白对照组、HGF＋VEGF-C＋bFGF组、bFGF＋VEGF-C＋HGF组、VEGF-C＋HGF＋bFGF组，每组样本数为3。空白对照组细胞加入2 mL完全培养基；HGF＋VEGF-C＋bFGF组细胞加入2 mL完全培养基、10 μg/mL HGF 16 μL、10 μg/mL VEGF-C 10 μL，6 h后加入1 μg/mL bFGF 20 μL。bFGF＋VEGF-C＋HGF组细胞加入2 mL完全培养基以及1 μg/mL bFGF 20 μL和10 μg/mL VEGF-C 10 μL，6 h后加入10 μg/mL HGF 16 μL；VEGF-C＋HGF＋bFGF组细胞同时加入2 mL完全培养基及同前浓度及量的3种诱导因子。另取2个批次大鼠BMSC，同前进行分组，除将HGF＋VEGF-C＋bFGF组、bFGF＋VEGF-C＋HGF组6 h的间隔时间调整为12、24 h外，其余处理方法同前。培养10 d，蛋白质印迹法检测LYVE-1、VEGFR3及整合素α9的蛋白表达。对数据行析因设计方差分析、单因素方差分析、LSD-t检验、Bonferroni校正。
结果(1)阴性对照组、CD90组、CD44组、CD34组细胞表面抗原阳性表达率分别为0.39%、99.84%、99.90%、0.57%。(2)培养10 d，空白对照组、HGF组、bFGF组、HGF＋bFGF组细胞呈长梭形，其余各组细胞呈多边形。(3)培养10 d，空白对照组、HGF组、bFGF组、HGF＋bFGF组细胞无LYVE-1、VEGFR3和整合素α9蛋白表达。培养10 d，VEGF-C＋HGF＋bFGF组细胞LYVE-1、VEGFR3和整合素α9的蛋白表达量均明显高于VEGF-C组(t＝24.21、11.04、15.43，P<0.01)、VEGF-C＋HGF组(t＝10.81、9.93、10.20，P<0.01)、VEGF-C＋bFGF组(t＝11.67、6.32、19.00，P<0.01)。VEGF-C＋HGF组及VEGF-C＋bFGF组细胞LYVE-1的蛋白表达量明显高于VEGF-C组(t＝8.69、15.20，P<0.01)；VEGF-C＋bFGF组细胞VEGFR3的蛋白表达量明显高于VEGF-C组及VEGF-C＋HGF组(t＝8.67、7.21，P<0.01)；VEGF-C＋HGF组细胞整合素α9的蛋白表达量明显高于VEGF-C组及VEGF-C＋bFGF组(t＝8.80、8.83，P<0.01)。(4)培养10 d，空白对照组、HGF组、bFGF组、HGF＋bFGF组细胞均无LYVE-1、VEGFR3和整合素α9 mRNA表达。培养10 d，VEGF-C组细胞LYVE-1、VEGFR3的mRNA表达量明显低于VEGF-C＋bFGF组、VEGF-C＋HGF＋bFGF组(tLYVE-1＝6.22、18.01，tVEGFR3＝8.49、15.34，P<0.01)，整合素α9的mRNA表达量明显低于VEGF-C＋HGF组、VEGF-C＋HGF＋bFGF组(t＝13.24、9.65，P<0.01)。VEGF-C＋HGF＋bFGF组细胞LYVE-1、VEGFR3和整合素α9的mRNA表达量明显高于VEGF-C＋HGF组、VEGF-C＋bFGF组(t＝13.92、11.95，13.72、5.27，5.64、9.10，P<0.01)。VEGF-C＋HGF组细胞VEGFR3 mRNA表达量明显低于VEGF-C＋bFGF组(t＝6.91，P<0.01)，整合素α9 mRNA表达量明显高于VEGF-C＋bFGF组(t＝11.69，P<0.01)。(5)间隔6、12、24 h培养10 d，空白对照组细胞均无LYVE-1、VEGFR3及整合素α9蛋白表达。间隔6、12、24 h培养10 d，HGF＋VEGF-C＋bFGF组、bFGF＋VEGF-C＋HGF组、VEGF-C＋HGF＋bFGF组细胞LYVE-1、VEGFR3及整合素α9蛋白表达量相近(F6 h＝2.25、2.47、2.19，F12 h＝2.93、1.47、3.25，F24 h＝0.28、0.20、1.01，P>0.05)。
结论VEGF-C是诱导BMSC向LEC分化必需的因子，HGF和bFGF可能分别是通过上调整合素α9和VEGFR3的表达来促进分化的，但二者的诱导作用可能是各自独立的。3种诱导因子联合作用诱导分化效果最佳。