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【摘要】目的：建立测定粗齿冷水花中Epihernandulcin含量的方法。方法：采用高效液相色谱法（HPLC）测定粗齿冷水花中Epihernandulcin含量，采用ECOSIL ODS-3反相色谱柱（250×46mm， 5μm），以乙腈-02%磷酸溶液（65：35）为流动相进行等度洗脱，检测波长为240nm，流速为1mL/min，柱温为室温。结果：Epihernandulcin在0114-0683μg范围内呈良好线性关系（r=09991），平均回收率为9950%，RSD=218%（n=9）。结论：该法简单，可行，重现性好，适用于粗齿冷水花中Epihernandulcin的含量测定。
【关键词】 粗齿冷水花；Epihernandulcin；高效液相色谱法；含量测定
【中图分类号】R2841【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）10-0022-03
The Determination of Epihernandulcin in Pilea sinofasciata C J Chen
HUANG YanWEN JianwenCHEN MingshengHE KaijiaLIU Buming*
Guangxi Institute of Traditional Medical and Pharmaceutical Sciences&Guangxi Key Laboratory of Tradtitonal Chinese Medicine Quality Stardands， Nanning 530022， China
Abstract：Objective To develop a determination method of epihernandulcin in Pilea sinofasciata C J Chen Methods The determination was performed on ECOSIL ODS-3（250×46mm， 5μm） column with acetonitrile-02% phosphoric acid（65：35） as mobile phase with flow rate 10 mL/min at detection wavelength of 240 nm And the column temperature was set at room temperature Results The average recovery rate（n=9） of epihernandulcin was 9950% and RSD was 218%（n=9）， respectively Conclusion The method is simple， rapid， accurate and reliable. And it is suitable for the quality control of epihernandulcin in Pilea sinofasciata C J Chen
Keywords： Pilea sinofasciata C J Chen；Epihernandulcin；HPLC；Determination
粗齒冷水花为荨麻科（Urticaceae）冷水花属（Pilea Lindl）植物粗齿冷水花Pilea sinofasciata C J Chen的全草，又名紫绿草、青药、水麻叶、水甘草、大茴香、宫麻，分布于我国广西、贵州、四川和云南等省，具有清热解毒，活血祛风，理气止痛，主治高热，鹅口疮，喉蛾肿痛，跌打损伤，骨折，风湿痹痛[1]。目前对粗齿冷水花的成分报道较少，牛延慧等[2]对冷水花属植物进行化学成分预实验研究。而本课题组对粗齿冷水花全草的乙醇提取物的化学成分进行了系统研究，其主要含有机酸类、生物碱类、黄酮类、倍半萜类、三萜类等化合物[3]；另外采用GC-MS法对粗齿冷水花的脂溶性成分进行了成分分析[4]，并对药材进行了薄层鉴定研究[5]。前期从粗齿冷水花分离得到epihernandulcin，而且含量较高，本文采用高效液相色谱（HPLC）对粗齿冷水花中epihernandulcin进行含量测定研究，为粗齿冷水花的质量控制提供科学的依据和理论基础。
1仪器与材料
11仪器HH-S恒温水浴锅，1525型液相色谱仪（美国Waters公司），2489型紫外检测仪（美国Waters公司），2707型自动进样仪（美国Waters公司），Breeze系统色谱工作站（美国Waters公司），XS205分析天平（梅特勒-托利多）。
12材料epihernandulcin对照品（自制）纯度>98%；甲醇（赛默飞世尔科技有限公司；色谱纯）、乙腈（赛默飞世尔科技有限公司有限公司；色谱纯）、磷酸（广州新建精细化工厂，分析纯），其他试剂均为分析纯。粗齿冷水花（Pilea sinofasciata C J Chen）采集于广西百色市，经广西中医药研究院何开家主任药师鉴定为粗齿冷水花Pilea sinofasciata CJChen。
2方法与结果
21色谱条件及系统适应性考察色谱柱：ECOSIL ODS-3（250×46mm， 5μm）；流动相：乙腈-02%磷酸溶液等度洗脱（65：35）；流速：10mL/min；检测波长：240nm；柱温：25℃；进样量：10μL。供试品溶液中Epihernandulcin的理论塔板数是12635，分离度大于15，完全分离。如图1、图2所示。
22溶液的制备
221对照品贮备液的制备精密称取epihernandulcin 对照品1138mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得对照品贮备液。 222供试品溶液的制备取粗齿冷水花粉末1g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，加热提取25h，放冷至室温，补足重量，摇匀，过滤，取续滤液，再用045μm微孔滤膜滤过，即得。
23标准曲线的制备精密量取对照品溶液10、20、30、40、50、60mL，分别置于10mL容量瓶中，加入流动相稀释定容至刻度，摇匀，配成系列浓度的对照品溶液，按“21项下的色谱条件”下进行测定。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。回归方程为：Y =12114828477X -3885010（n=6），r=09997，表明对照品进样量在0114～0683μg范围内线性关系良好，标准曲线见图3。
24精密度试验取同一供试品溶液，精密吸取10μL，按“21色谱条件”连续进样6次，测定峰面积，结果显示RSD%小于2，表明仪器精密度良好。
25稳定性考察取供试品溶液按“21色谱条件”分别在0、1、2、4、6、8、10、12小时进行结果RSD值为075%，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。
26重复性考察取同一批次药材适量，按照“22溶液的制备”方法制备6份供试品溶液，按“21色谱条件”进行测定，结果RSD值为218%，表明重复性良好。
27加样回收率考察取已知Epihernandulcin含量的粗齿冷水花粉末05g，共9份，精密称定，置于1～9号锥形瓶中，1至3号精密加入01mg/mL的Epihernandulcin对照品溶液07 mL，4～6号精密加入01mg/mL的Epihernandulcin对照品溶液09mL，7至9号精密加入01mg/mL的Epihernandulcin对照品溶液11mL，按照“22溶液的制备”方法制备，按“21色谱条件”实验。结果Epihennandulcim的平均回收率9950%，RSD值为196%。见表1。
28样品测定精密称取不同批次粗齿冷水花末各10g，按“22溶液的制备”方法制备，按“21色谱条件”测定，测定Epihernandulcin含量，结果见表2。
3讨论
31提取方法考察试验过程中考察了加热回流和超声处理两种方式，结果显示加热回流样品中Epihernandulcin所测定的含量要高，故采用加热回流提取方式。
32提取溶剂的考察试验过程中分别考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇为提取溶剂，结果显示甲醇提取含量较多，故采用甲醇作为提取溶剂。
33提取时间的考察试验过程中分别考察了加热回流提取时间为30、60、90、120、150、180min，结果显示150min基本可以将供试品中的Epihernandulcin提取完全，故选择150min作为提取时间。
实验还比较了采集百色不同产地的3批次粗齿冷水花中Epihernandulcin含量，其中Epihernandulcin（01792mg/g）的含量以百色凌云县产地采集得到的药材为最高。
参考文献
[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草[M]. 上海：上海科学出版社， 1999：577.
[2]牛延慧， 梁志远， 甘秀海. 贵州三种冷水花化学成分预试研究[J]. 贵州师范学院学报， 2010， 26（3）：26-28.
[3] 黄艳， 武旭， 文建文， 等. 粗齿冷水花的化学成分研究[J]. 中草药， 2016， 47（18）：3159-3163.
[4] 文建文， 黄艳， 何开家， 等. GC-MS 法分析粗齿冷水花石油醚部位的脂溶性成分[J].安徽农业科技， 2010， 41（36）：14156， 14168.
[5]武旭， 柴玲， 黄艳， 等. 粗齿冷水花药材的薄层鉴别研究[J]. 现代中药研究与实践， 2016， 30（1）：17-20.
（收稿日期：2017-03-24編辑：陶希睿）
【关键词】 粗齿冷水花；Epihernandulcin；高效液相色谱法；含量测定
【中图分类号】R2841【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2017）10-0022-03
The Determination of Epihernandulcin in Pilea sinofasciata C J Chen
HUANG YanWEN JianwenCHEN MingshengHE KaijiaLIU Buming*
Guangxi Institute of Traditional Medical and Pharmaceutical Sciences&Guangxi Key Laboratory of Tradtitonal Chinese Medicine Quality Stardands， Nanning 530022， China
Abstract：Objective To develop a determination method of epihernandulcin in Pilea sinofasciata C J Chen Methods The determination was performed on ECOSIL ODS-3（250×46mm， 5μm） column with acetonitrile-02% phosphoric acid（65：35） as mobile phase with flow rate 10 mL/min at detection wavelength of 240 nm And the column temperature was set at room temperature Results The average recovery rate（n=9） of epihernandulcin was 9950% and RSD was 218%（n=9）， respectively Conclusion The method is simple， rapid， accurate and reliable. And it is suitable for the quality control of epihernandulcin in Pilea sinofasciata C J Chen
Keywords： Pilea sinofasciata C J Chen；Epihernandulcin；HPLC；Determination
粗齒冷水花为荨麻科（Urticaceae）冷水花属（Pilea Lindl）植物粗齿冷水花Pilea sinofasciata C J Chen的全草，又名紫绿草、青药、水麻叶、水甘草、大茴香、宫麻，分布于我国广西、贵州、四川和云南等省，具有清热解毒，活血祛风，理气止痛，主治高热，鹅口疮，喉蛾肿痛，跌打损伤，骨折，风湿痹痛[1]。目前对粗齿冷水花的成分报道较少，牛延慧等[2]对冷水花属植物进行化学成分预实验研究。而本课题组对粗齿冷水花全草的乙醇提取物的化学成分进行了系统研究，其主要含有机酸类、生物碱类、黄酮类、倍半萜类、三萜类等化合物[3]；另外采用GC-MS法对粗齿冷水花的脂溶性成分进行了成分分析[4]，并对药材进行了薄层鉴定研究[5]。前期从粗齿冷水花分离得到epihernandulcin，而且含量较高，本文采用高效液相色谱（HPLC）对粗齿冷水花中epihernandulcin进行含量测定研究，为粗齿冷水花的质量控制提供科学的依据和理论基础。
1仪器与材料
11仪器HH-S恒温水浴锅，1525型液相色谱仪（美国Waters公司），2489型紫外检测仪（美国Waters公司），2707型自动进样仪（美国Waters公司），Breeze系统色谱工作站（美国Waters公司），XS205分析天平（梅特勒-托利多）。
12材料epihernandulcin对照品（自制）纯度>98%；甲醇（赛默飞世尔科技有限公司；色谱纯）、乙腈（赛默飞世尔科技有限公司有限公司；色谱纯）、磷酸（广州新建精细化工厂，分析纯），其他试剂均为分析纯。粗齿冷水花（Pilea sinofasciata C J Chen）采集于广西百色市，经广西中医药研究院何开家主任药师鉴定为粗齿冷水花Pilea sinofasciata CJChen。
2方法与结果
21色谱条件及系统适应性考察色谱柱：ECOSIL ODS-3（250×46mm， 5μm）；流动相：乙腈-02%磷酸溶液等度洗脱（65：35）；流速：10mL/min；检测波长：240nm；柱温：25℃；进样量：10μL。供试品溶液中Epihernandulcin的理论塔板数是12635，分离度大于15，完全分离。如图1、图2所示。
22溶液的制备
221对照品贮备液的制备精密称取epihernandulcin 对照品1138mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，即得对照品贮备液。 222供试品溶液的制备取粗齿冷水花粉末1g，精密称定，置于锥形瓶中，精密加入甲醇10mL，密塞，称定重量，加热提取25h，放冷至室温，补足重量，摇匀，过滤，取续滤液，再用045μm微孔滤膜滤过，即得。
23标准曲线的制备精密量取对照品溶液10、20、30、40、50、60mL，分别置于10mL容量瓶中，加入流动相稀释定容至刻度，摇匀，配成系列浓度的对照品溶液，按“21项下的色谱条件”下进行测定。以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，计算回归方程。回归方程为：Y =12114828477X -3885010（n=6），r=09997，表明对照品进样量在0114～0683μg范围内线性关系良好，标准曲线见图3。
24精密度试验取同一供试品溶液，精密吸取10μL，按“21色谱条件”连续进样6次，测定峰面积，结果显示RSD%小于2，表明仪器精密度良好。
25稳定性考察取供试品溶液按“21色谱条件”分别在0、1、2、4、6、8、10、12小时进行结果RSD值为075%，表明供试品溶液在12h内稳定性良好。
26重复性考察取同一批次药材适量，按照“22溶液的制备”方法制备6份供试品溶液，按“21色谱条件”进行测定，结果RSD值为218%，表明重复性良好。
27加样回收率考察取已知Epihernandulcin含量的粗齿冷水花粉末05g，共9份，精密称定，置于1～9号锥形瓶中，1至3号精密加入01mg/mL的Epihernandulcin对照品溶液07 mL，4～6号精密加入01mg/mL的Epihernandulcin对照品溶液09mL，7至9号精密加入01mg/mL的Epihernandulcin对照品溶液11mL，按照“22溶液的制备”方法制备，按“21色谱条件”实验。结果Epihennandulcim的平均回收率9950%，RSD值为196%。见表1。
28样品测定精密称取不同批次粗齿冷水花末各10g，按“22溶液的制备”方法制备，按“21色谱条件”测定，测定Epihernandulcin含量，结果见表2。
3讨论
31提取方法考察试验过程中考察了加热回流和超声处理两种方式，结果显示加热回流样品中Epihernandulcin所测定的含量要高，故采用加热回流提取方式。
32提取溶剂的考察试验过程中分别考察了甲醇、50%甲醇、乙醇、50%乙醇为提取溶剂，结果显示甲醇提取含量较多，故采用甲醇作为提取溶剂。
33提取时间的考察试验过程中分别考察了加热回流提取时间为30、60、90、120、150、180min，结果显示150min基本可以将供试品中的Epihernandulcin提取完全，故选择150min作为提取时间。
实验还比较了采集百色不同产地的3批次粗齿冷水花中Epihernandulcin含量，其中Epihernandulcin（01792mg/g）的含量以百色凌云县产地采集得到的药材为最高。
参考文献
[1]国家中医药管理局《中华本草》编委会. 中华本草[M]. 上海：上海科学出版社， 1999：577.
[2]牛延慧， 梁志远， 甘秀海. 贵州三种冷水花化学成分预试研究[J]. 贵州师范学院学报， 2010， 26（3）：26-28.
[3] 黄艳， 武旭， 文建文， 等. 粗齿冷水花的化学成分研究[J]. 中草药， 2016， 47（18）：3159-3163.
[4] 文建文， 黄艳， 何开家， 等. GC-MS 法分析粗齿冷水花石油醚部位的脂溶性成分[J].安徽农业科技， 2010， 41（36）：14156， 14168.
[5]武旭， 柴玲， 黄艳， 等. 粗齿冷水花药材的薄层鉴别研究[J]. 现代中药研究与实践， 2016， 30（1）：17-20.
（收稿日期：2017-03-24編辑：陶希睿）