【摘 要】
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目的 采用Gateway技术构建适合酵母表达的小鼠巨噬细胞cDNA文库并进行鉴定。方法将小鼠巨噬细胞的mRNA分离纯化后，以生物素标记的寡聚胸苷酸Oligo（dT）为引物反转录后连接attB衔接子（attBAdapter），层析柱纯化，通过BP重组反应将500bp以上的片段克隆到含attP衔接子的pDONR^TM222载体，电转化人ElectroMAX^TMDHIOB^TM T1 Phage Re
【机 构】
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目的 采用Gateway技术构建适合酵母表达的小鼠巨噬细胞cDNA文库并进行鉴定。方法将小鼠巨噬细胞的mRNA分离纯化后，以生物素标记的寡聚胸苷酸Oligo（dT）为引物反转录后连接attB衔接子（attBAdapter），层析柱纯化，通过BP重组反应将500bp以上的片段克隆到含attP衔接子的pDONR^TM222载体，电转化人ElectroMAX^TMDHIOB^TM T1 Phage Resistant Cells，构建Gateway入门cDNA文库，并完全随机挑取单菌落，提取质粒酶切鉴定重组子插入片段大小。构建Gateway目的载体，通过LR重组反应将入门文库转入此目的载体成为酵母表达文库，挑取单克隆鉴定重组子插入片段大小。结果经鉴定，入门文库平均滴度为（6．80±0．10）×10^5cfu／ml，文库总容量为7．48×10^6cfu，平均插入片段为（2．20±0．20）kb，重组率为100％。酵母表达文库平均滴度为（3．24±0．10）×10^6cfu／ml，文库总容量为3．89×10^7cfu，平均插入的片段为（2．27±0．15）kb，重组率为95．83％（23／24）。结论构建的小鼠巨噬细胞cDNA入门文库和酵母表达文库都符合高质量文库的要求，可用于进一步的研究。
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