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大肠癌是临床最常见的恶性肿瘤之一，在全世界范围内，大肠癌的发病率男女均处于恶性肿瘤的第3位，在我国，随着生活水平的不断提高，饮食习惯的改变，大肠癌的发病率呈上升态势，排在恶性肿瘤和致死因素的第4位，大肠癌是我国肿瘤患者死亡的主要原因之一。微小RNA是一种真核生物内源性小分子单链RNA，微小RNA分子通过翻译抑制或者其他形式的调节机制抑制靶基因的表达。目前，已发现多种微小RNA在大肠癌组织及大肠癌细胞系中异常表达，我们应用实时定量反转录聚合酶联反应技术，在大肠癌组织和对应正常大肠黏膜中进行miR-21的表达水平检测，并结合术后病理资料，分析miR-21与大肠癌临床病理因素的相关性，以其为大肠癌诊断和抗转移治疗提供新的线索。
资料与方法
2010年6月～2011年5月收治进展期大肠癌患者64例，手术切除的肿瘤组织，全部患者均经病理证实为进展期大肠癌，术前均未行放化疗，所以患者均取得知情同意，同时收集距癌灶>5cm正常肠黏膜组织作为正常对照。
试剂与仪器：微小RNA提取试剂盒及聚合RNA加尾试剂盒均为美国安边公司产品，逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶联反应试剂盒为日本塔克拉公司产品，实时定量聚合酶联反应仪购自美国寇伯特公司。
方法：总RNA抽提取10mg大肠癌组织及对照正常黏膜组织，按照使用Ambion公司的微小RNA提取试剂说明书步骤提取总RNA。然后对RNA加尾，由于miRNAs是长约22核苷酸的短小片段RNA，常规聚合酶联反应无法设计出上下游引物。本实验中我们先对所有RNA的3’末端加聚苷腺酸尾巴，对其人为地增加长度。反转录过程中，所使用的引物3’端为一人为设计的序列，具体步骤参照Ambion公司的聚苷腺酸加尾试剂盒说明书。逆转录及荧光定量聚合酶联反应时，以u6管家基因做为内参，每个标本设3个复孔。取总RNA为模板，按照逆转录试剂盒说明书配反应体系，逆转录出互补DNA；然后按照实时荧光定量聚合酶联反应试剂盒说明书。对实时定量荧光聚合酶联反应的结果运用△△CT法进行分析。△CT=目的基因CT-内参照基因CT值。
统计学处理：建立病例资料量化表格，应用SPSS13.0统计分析，组间的比较采用四格表或行列资料表X2检验，P<0.05认为具有统计学意义。
结果
将64对标本术后病理资料完整收集整理后，分析了癌组织中miR-21相对表达水平与其病理因素的相关性，包括：临床病理分期、癌灶大小，浸润深度，大体类型，组织分化、淋巴结转移。64例中癌组织miR-21表达上调38例，下调26例，统计学分析显示，在不同浸润深度组别中，miR-21的上调比例存在明显差异，随着浸入深度增加（肌层→浆膜下→浆膜外），miR-21高表达比例明显增加，差异有统计学意义（P<0.01）。
討论
miRNAs是一类在动植物中广泛存在、高度保守的小分子非编码RNA，含有18～25个核苷酸，通常微小RNA在转录后水平调控基因表达。已有研究表明一些miRNAs在正常组织和大肠癌组织中的表达显著不同，有些miRNAs在肿瘤组织中高表达，有些则在肿瘤组织中低表达，一部分研究还对miRNAs的功能做了初步研究。目前，已有研究发现miR-21在多种癌组织中呈高表达状态，包括乳腺癌、胃癌、大肠癌等，而且对其功能也做了不少研究，找到了部分miR-21下游靶基因mRNA。德国学者Asangani IA等通过生物信息学技术研究发现在大肠癌细胞中miR-21在转录后水平下调Pdcd4蛋白的表达1，而且具有刺激大肠癌细胞局部浸润和远处转移作用。
本试验选取了中国北方人群中64例大肠癌组织作为研究材料，检测癌组织与癌旁正常组织中miR-21相对表达水平，结合临床病理因素分析，发现miR-21表达上调在浸润深度不同组别中存在明显差异，随着浸入深度增加（肌层→浆膜下→浆膜外），miR-21表达上调比例明显增加，提示miR-21可能与大肠癌细胞浸袭能力有关，miR-21高表达预示着浸润深度增加，病期较晚。miR-21可能作为一个提示病期晚的指标，但由于我们选取的病例数目较少，需要进一步大规模研究验证证。
参考文献
1Asangani IA，Rasheed SA，Nikolova DA，et al.MicroRNA-21（miR-21）post-transcriptionally downregulates tumor suppressor Pdcd4 and stimulates invasion，intravasation and metastasis in colorectal cancer[J].Oncogene，2008，27（15）：21.
资料与方法
2010年6月～2011年5月收治进展期大肠癌患者64例，手术切除的肿瘤组织，全部患者均经病理证实为进展期大肠癌，术前均未行放化疗，所以患者均取得知情同意，同时收集距癌灶>5cm正常肠黏膜组织作为正常对照。
试剂与仪器：微小RNA提取试剂盒及聚合RNA加尾试剂盒均为美国安边公司产品，逆转录试剂盒、实时荧光定量聚合酶联反应试剂盒为日本塔克拉公司产品，实时定量聚合酶联反应仪购自美国寇伯特公司。
方法：总RNA抽提取10mg大肠癌组织及对照正常黏膜组织，按照使用Ambion公司的微小RNA提取试剂说明书步骤提取总RNA。然后对RNA加尾，由于miRNAs是长约22核苷酸的短小片段RNA，常规聚合酶联反应无法设计出上下游引物。本实验中我们先对所有RNA的3’末端加聚苷腺酸尾巴，对其人为地增加长度。反转录过程中，所使用的引物3’端为一人为设计的序列，具体步骤参照Ambion公司的聚苷腺酸加尾试剂盒说明书。逆转录及荧光定量聚合酶联反应时，以u6管家基因做为内参，每个标本设3个复孔。取总RNA为模板，按照逆转录试剂盒说明书配反应体系，逆转录出互补DNA；然后按照实时荧光定量聚合酶联反应试剂盒说明书。对实时定量荧光聚合酶联反应的结果运用△△CT法进行分析。△CT=目的基因CT-内参照基因CT值。
统计学处理：建立病例资料量化表格，应用SPSS13.0统计分析，组间的比较采用四格表或行列资料表X2检验，P<0.05认为具有统计学意义。
结果
将64对标本术后病理资料完整收集整理后，分析了癌组织中miR-21相对表达水平与其病理因素的相关性，包括：临床病理分期、癌灶大小，浸润深度，大体类型，组织分化、淋巴结转移。64例中癌组织miR-21表达上调38例，下调26例，统计学分析显示，在不同浸润深度组别中，miR-21的上调比例存在明显差异，随着浸入深度增加（肌层→浆膜下→浆膜外），miR-21高表达比例明显增加，差异有统计学意义（P<0.01）。
討论
miRNAs是一类在动植物中广泛存在、高度保守的小分子非编码RNA，含有18～25个核苷酸，通常微小RNA在转录后水平调控基因表达。已有研究表明一些miRNAs在正常组织和大肠癌组织中的表达显著不同，有些miRNAs在肿瘤组织中高表达，有些则在肿瘤组织中低表达，一部分研究还对miRNAs的功能做了初步研究。目前，已有研究发现miR-21在多种癌组织中呈高表达状态，包括乳腺癌、胃癌、大肠癌等，而且对其功能也做了不少研究，找到了部分miR-21下游靶基因mRNA。德国学者Asangani IA等通过生物信息学技术研究发现在大肠癌细胞中miR-21在转录后水平下调Pdcd4蛋白的表达1，而且具有刺激大肠癌细胞局部浸润和远处转移作用。
本试验选取了中国北方人群中64例大肠癌组织作为研究材料，检测癌组织与癌旁正常组织中miR-21相对表达水平，结合临床病理因素分析，发现miR-21表达上调在浸润深度不同组别中存在明显差异，随着浸入深度增加（肌层→浆膜下→浆膜外），miR-21表达上调比例明显增加，提示miR-21可能与大肠癌细胞浸袭能力有关，miR-21高表达预示着浸润深度增加，病期较晚。miR-21可能作为一个提示病期晚的指标，但由于我们选取的病例数目较少，需要进一步大规模研究验证证。
参考文献
1Asangani IA，Rasheed SA，Nikolova DA，et al.MicroRNA-21（miR-21）post-transcriptionally downregulates tumor suppressor Pdcd4 and stimulates invasion，intravasation and metastasis in colorectal cancer[J].Oncogene，2008，27（15）：21.