论文部分内容阅读
摘 要：随着SSR分子标记技术在玉米室内测纯、一致性及真实性鉴定等方面的应用，该技术已经逐渐成为种子企业质量检测后控的基本手段。但由于其检测量大，准确性要求高的特点，使其对DNA提取质量的要求增加。该文以快速DNA提取方法为基础，在普通的实验条件下，设置4种不同沸水浴的碱煮时间，比较提取DNA后的电泳效果，寻求适合一般种子企业实验室SSR分子试验要求的DNA快速提取方法，为种子企业的快速质量测定奠定基础。
关键词：SSR;DNA快速提取;碱煮时间
中图分类号 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）12-0020-3
Abstract：With the use of SSR technology in the aspects of corn chamber test purity，consistency and authenticity identification，this technology has gradually become the seed enterprise quality testing after the control of the basic means.Due to its high detection quantity and high accuracy，the requirement of DNA extraction quality is increased.In this paper，based on the previous human rapid DNA extraction method，under the general experimental conditions of seed enterprises，four different boiling water bath alkali boiling time was set to compare the effect of DNA extraction after electrophoresis，to find a suitable method for rapid DNA extraction in the laboratory of seed enterprises，so as to lay a foundation for rapid quality determination of seed enterprises.
Key words：SSR;Rapid DNA extraction;Alkali boiling time
近些年来，由于分子标记技术具有明显的多态性、共显性、重复性等优点，已被广泛应用于种子的纯度、一致性、真实性检测、分子标记辅助选择以及转基因检测等方面，其中SSR分子标记技术应用最广。而在整个SSR试验过程，从DNA提起到扩增再到电泳，DNA提取是整个技术过程的前提和关键，如何提取质量较好的DNA，将影响到后面扩增环节，并最终影响到电泳的结果。前人的研究中，李荣华[1]通过改进CTAB法提取高纯度DNA;王艳[2]利用试剂盒进行DNA快速提取;郭景伦[3-4]的玉米单粒DNA快速提取方法简单有效，被广泛应用。利用种子胚乳进行碱煮，此方法极大地提高了检测效率，尤其在种子企业的纯度检测方面应用最广。易红梅[5]针对种子胚、胚乳、芽鞘、苗等不同部位提取的DNA效果进行了比较研究，确定了不同部位提取最好DNA的最佳时间，为进一步推广快提法奠定了基础。
在郭景伦[1]的快提法中，采用的是96孔深孔板，一道电泳，效果明显。而在实际操作中，为了更好地提高试验的便利性及经济性，通常采用普通PCR板（96孔、200μL），在不影响检测结果的前提下，会涉及多道扩增产物一起电泳，以节约试验成本。图1所示的谱带类型在日常电泳中经常遇到，带型间的拖尾现象逐条加重，提取DNA的质量和纯度都存在一定的问题[6]，影响带型分析的准确性。
如何改進方法使其能够满足日常测纯、一致性检测等多重电泳的需要，本研究以郭景伦的快速提取方法为背景，针对一般实验室的基本条件和实际操作情况，采用普通PCR板（96孔、200μL），多道引物电泳，比较不同碱煮时间对快速提取DNA效果的影响，探寻适合一般实验室适用的检测方法，为更加高效、准确的进行室内测纯、一致性及真实性鉴定以及高通量的DNA指纹鉴定平台提供参考。
1 材料和方法
1.1 供试材料 试验品种为农单476，农单476父本、农单476母本，由安徽丰大种业公司实验室提供。试验SSR引物由上海生工合成，仪器采用ZAG电泳分析仪。
1.2 DNA提取 利用刻刀取下一部分干种子的胚乳，放入96孔板（200μL）中，每孔加入DNA提取液A（0.2m/L NaOH）40μL，提取液B（0.17M/LTris-HCl）60μL，设定4种处理方式，分别按表1进行沸水浴。提取后的DNA放4℃冰箱保存留用。
1.3 PCR扩增 取DNA2.0μL进行扩增，每个处理组从20对核心引物中选定的扩增效果较好的3对引物进行扩增，采用10μL体系，其中包括：DNA模板2μL、DNTP1.6μL、buffer2μL、引物0.8μL、taq酶0.1μL、ddH2O3.5μL。SSR反应程序为：94℃预变性、5min、1个循环，94℃变性、30S，55℃退火、30S，72℃延伸、30S，共30个循环，4℃保存。
1.4 电泳及银染 将扩增好的产物加入1μL溴酚蓝指示剂，在4%PAGE丙烯酰胺凝胶中进行电泳，100w，25min，每块胶点样3道。电泳完成后取下玻璃板，在双蒸水中快速漂洗一次，放入0.2%AgNO3中浸染10min后，再次漂洗1次后放入0.4%NaOH和0.5%甲醛的混合液中浸泡直至显影。结束后对所有提取的DNA原液进行稀释1倍，重复以上操作，且对处理1组分别进行PAGE凝胶电泳和毛细管电泳，比较两者的应用效果。 2 结果与分析
2.1 不同煮沸时间对快速提取DNA效果的影响 利用快提法取用玉米种子胚乳，设置不同的煮沸时间提取DNA并进行PCR检测。4个处理组，每个处理组扩增3个引物，每板胶点样3道，效果如图2所示。由图2可知，在处理Ⅰ和Ⅱ中，扩增效果较好，每条带型清晰，能够进行带型分析处理，但在处理Ⅲ和Ⅳ中，第1条带效果清晰，第2条次之，第3条模糊，3条间已相互影响，且拖尾显现逐次加重。
图2表明，每个处理组间提取的DNA含量均较高，3条带在有相互重复的区域都存在拖尾现象，且处理Ⅲ和处理Ⅳ最为严重，第3条带正常的分析已受到影响。对比各处理间的第1条带，差异不大，但随着碱煮时间的延长，每个处理间在第2、第3条带间呈现出拖尾程度不同的现象。当碱煮时间小于3min，即Ⅰ、Ⅱ处理，拖尾不明显，带型分析不受影响;当碱煮时间大于5min时，即Ⅲ、Ⅳ处理，拖尾现象逐条加深，带型分析受到影响。说明了控制碱煮时间是影响DNA提取质量的关键。
分析不同煮沸时间引起的带型差异，利用胚乳进行煮沸快速提取DNA，由于整个提取液中含有多糖、蛋白质、叶绿素等细胞内含物杂质以及一些化学物质，随着煮沸时间的延长，细胞的破损程度增大，内含物的释放量也随之增大，整个提取液及扩增后的产物中含有的杂质也逐渐增多，影响扩增产物的正常电泳，致使多重电泳时，每条带型间相互影响，影响读带的准确性。
2.2 快速提取DNA经稀释后对扩增效果的影响 从图1中发现，提取的DNA浓度过高且每个处理间都存在拖尾现象。在PCR扩增时若DNA含量足够且能降低原液中各种杂质的含量，将能进一步提高电泳谱带的清晰度。进而我们对提取的DNA原液进行稀释1倍处理，重复试验过程，凝胶电泳结果如图3所示。由图3可知，快速提取后的DNA原液经稀释后，不同处理间扩增后电泳谱带的清晰度增加，且拖尾现象不同程度的得到减轻。在处理Ⅰ、Ⅱ中，带型清晰可辨，尤其在Ⅰ中，第3条带依然不受影响。而在处理Ⅲ、Ⅳ中，虽带型的清晰度增加，但没有处理Ⅰ、Ⅱ中明显，依然存在拖尾。说明了提取的DNA原液经稀释后，DNA的含量能够满足SSR试验的需要，且使单位体积内模板中杂质含量减少，电泳后谱带的效果更加清晰。
2.3 快提DNA稀释前后在毛细管检测系统中的应用效果 对试验中处理Ⅰ组的DNA原液分别进行稀释前后的PCR扩增，然后放至毛细管系统中进行电泳，比较效果的差异。图4、5表明，稀释前的DNA经电泳后主峰明显，峰值较高，但存在明显非特异峰;经稀释1倍后主峰较明显，峰值适中，存在非特异性峰但不明显，表明DNA原液稀释后明显的降低了非特异性峰的出现，使主峰更加清晰明辨。同时也证实了处理Ⅰ中提取的DNA可以用于毛细管系统检测，但经稀释后更适合毛细管带型分析。
3 结论与讨论
3.1 控制碱煮时间能有效提高快提法提取DNA的效果 通过切取种子胚乳进行快速提取DNA，能够满足日常检测的需要，这与郭景伦、王风格[3]等的研究一致。通过在沸水中碱煮，能够使细胞迅速破裂[7]，释放出包含DNA在内的一些细胞内含物（多糖、蛋白质等杂质）[8]，为下一步DNA的扩增提供基础，极大地提高了工作效率。但在一般种子企业实验室中，涉及到多重电泳中出现的拖尾问题，为此，本研究设置4种不同的碱煮时间，比较多重电泳后显影的效果。结果表明，在普通的PCR板（96孔，200μL）上碱煮时间3min内提取的DNA，多重电泳后拖尾现象不明显，不影响正常带型分析工作，但碱煮超过5min后，条带间相互影响，拖尾现象严重。
同时，在对DNA原液稀释后再次试验，发现每个处理间的条带清晰度增加，拖尾现象减轻，且碱煮时间在3min内的2组多重电泳后的条带间几乎不受影响。降低杂质含量是解决拖尾现象的关键，碱煮时间越长，细胞内含物的释放越充分，提取的DNA中含有的杂质量越多，扩增及电泳受到的影响就越大。经稀释后，各种杂质的含量比例降低，但DNA的含量仍能达到扩增的需要，最终电泳显影后效果较好。对比分析表明，碱煮的时间长短影响了最终提取DNA的质量，针对普通PCR板，控制碱煮时间3min内，再进行稀释1倍处理，电泳效果最好，不影响日常检测工作的准确性。
3.2 切粒快提法在现代检测仪器中的利用 随着快提法的推广应用，不仅在纯度、一致性及真实性检测上提高了检测效率，而且能够在分子选育上使室内和田间有效的结合，胚没有损伤的种子仍能种到田间观察表现[9]。但随着现代检测仪器毛细管电泳[10]的使用，如高通量检测仪器3730L、ZAG等，使得检测准确率得到了极大的提升，同时也对扩增产物的质量提出了一定的要求。通过切粒沸水碱煮提取DNA，提取液中除了含有一些可溶類杂质外，其中仍含有切除不可溶解的胚或胚乳微粒，致使在扩增时吸取的DNA模板将会含有这些可溶或不可溶物质。由于毛细管电泳仪器的精密性，维护成本较高，结合仪器自身特性，细小的微粒可能会造成毛细管孔堵塞，增大仪器的使用风险。在日常利用毛细管的检测中，尽可能的使用胚芽或叶片进行快提，前人的研究[5]已经证实，发芽3d左右的嫩叶提取的DNA完全满足SSR的要求且适合毛细管系统检测。切粒提取的DNA原液，可以对其进行1～1.5倍的稀释，以降低模板不可溶物质的含量，在不影响检测准确度的基础上，尽量减少毛细管仪器的使用风险。
参考文献
[1]李荣华，夏岩石，刘顺枝，等.改进的CTAB提取植物DNA方法[J].实验室研究与探索，2009，28（9）：14-16.
[2]王艳，李韶山.植物总DNA样品的快速制备[J].激光生物学报，2000，9（1）：79-80.
[3]郭景伦，赵久然，王凤格.适用于SSR分子标记的玉米单粒种子DNA快速提取新方法[J].玉米科学，2005，13（2）：16-17.
[4]郭景伦，王斌.玉米单粒种子DNA提取新方法[J].农业新技术，1997（2）：1-2.
[5]易红梅，张芳，王凤格，等.不同取样方式对DNA快速提取效果的影响[J].华北农学报，2007，22（5）：114-116.
[6]闫燕，许文涛，苏春元，等.平菇基因组DNA提取方法的研究[J].食品工业科技，2011（9）：190-193.
[7]曾乐平，周洪波，黄菊芳.一种经济、简单的微生物基因组DNA的提取方法[J].生态环境学报，2005，14（6）：945-946.
[8]刘泳，杨官品.碱煮法：一种制备海洋浮游生物PCR模板DNA的实用方法[J].海洋科学，2004，28（7）：1-3.
[9]李心平，马福丽，高连兴.玉米种子的机械损伤对其发芽率的影响[J].农机化研究，2009，31（3）：34-35.
[10]戴剑，张云辉.SSR扩增产物检测方法比较及其实验操作注意事项[J].种子，2013，32（9）：120-123.
（责编：张宏民）
关键词：SSR;DNA快速提取;碱煮时间
中图分类号 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2019）12-0020-3
Abstract：With the use of SSR technology in the aspects of corn chamber test purity，consistency and authenticity identification，this technology has gradually become the seed enterprise quality testing after the control of the basic means.Due to its high detection quantity and high accuracy，the requirement of DNA extraction quality is increased.In this paper，based on the previous human rapid DNA extraction method，under the general experimental conditions of seed enterprises，four different boiling water bath alkali boiling time was set to compare the effect of DNA extraction after electrophoresis，to find a suitable method for rapid DNA extraction in the laboratory of seed enterprises，so as to lay a foundation for rapid quality determination of seed enterprises.
Key words：SSR;Rapid DNA extraction;Alkali boiling time
近些年来，由于分子标记技术具有明显的多态性、共显性、重复性等优点，已被广泛应用于种子的纯度、一致性、真实性检测、分子标记辅助选择以及转基因检测等方面，其中SSR分子标记技术应用最广。而在整个SSR试验过程，从DNA提起到扩增再到电泳，DNA提取是整个技术过程的前提和关键，如何提取质量较好的DNA，将影响到后面扩增环节，并最终影响到电泳的结果。前人的研究中，李荣华[1]通过改进CTAB法提取高纯度DNA;王艳[2]利用试剂盒进行DNA快速提取;郭景伦[3-4]的玉米单粒DNA快速提取方法简单有效，被广泛应用。利用种子胚乳进行碱煮，此方法极大地提高了检测效率，尤其在种子企业的纯度检测方面应用最广。易红梅[5]针对种子胚、胚乳、芽鞘、苗等不同部位提取的DNA效果进行了比较研究，确定了不同部位提取最好DNA的最佳时间，为进一步推广快提法奠定了基础。
在郭景伦[1]的快提法中，采用的是96孔深孔板，一道电泳，效果明显。而在实际操作中，为了更好地提高试验的便利性及经济性，通常采用普通PCR板（96孔、200μL），在不影响检测结果的前提下，会涉及多道扩增产物一起电泳，以节约试验成本。图1所示的谱带类型在日常电泳中经常遇到，带型间的拖尾现象逐条加重，提取DNA的质量和纯度都存在一定的问题[6]，影响带型分析的准确性。
如何改進方法使其能够满足日常测纯、一致性检测等多重电泳的需要，本研究以郭景伦的快速提取方法为背景，针对一般实验室的基本条件和实际操作情况，采用普通PCR板（96孔、200μL），多道引物电泳，比较不同碱煮时间对快速提取DNA效果的影响，探寻适合一般实验室适用的检测方法，为更加高效、准确的进行室内测纯、一致性及真实性鉴定以及高通量的DNA指纹鉴定平台提供参考。
1 材料和方法
1.1 供试材料 试验品种为农单476，农单476父本、农单476母本，由安徽丰大种业公司实验室提供。试验SSR引物由上海生工合成，仪器采用ZAG电泳分析仪。
1.2 DNA提取 利用刻刀取下一部分干种子的胚乳，放入96孔板（200μL）中，每孔加入DNA提取液A（0.2m/L NaOH）40μL，提取液B（0.17M/LTris-HCl）60μL，设定4种处理方式，分别按表1进行沸水浴。提取后的DNA放4℃冰箱保存留用。
1.3 PCR扩增 取DNA2.0μL进行扩增，每个处理组从20对核心引物中选定的扩增效果较好的3对引物进行扩增，采用10μL体系，其中包括：DNA模板2μL、DNTP1.6μL、buffer2μL、引物0.8μL、taq酶0.1μL、ddH2O3.5μL。SSR反应程序为：94℃预变性、5min、1个循环，94℃变性、30S，55℃退火、30S，72℃延伸、30S，共30个循环，4℃保存。
1.4 电泳及银染 将扩增好的产物加入1μL溴酚蓝指示剂，在4%PAGE丙烯酰胺凝胶中进行电泳，100w，25min，每块胶点样3道。电泳完成后取下玻璃板，在双蒸水中快速漂洗一次，放入0.2%AgNO3中浸染10min后，再次漂洗1次后放入0.4%NaOH和0.5%甲醛的混合液中浸泡直至显影。结束后对所有提取的DNA原液进行稀释1倍，重复以上操作，且对处理1组分别进行PAGE凝胶电泳和毛细管电泳，比较两者的应用效果。 2 结果与分析
2.1 不同煮沸时间对快速提取DNA效果的影响 利用快提法取用玉米种子胚乳，设置不同的煮沸时间提取DNA并进行PCR检测。4个处理组，每个处理组扩增3个引物，每板胶点样3道，效果如图2所示。由图2可知，在处理Ⅰ和Ⅱ中，扩增效果较好，每条带型清晰，能够进行带型分析处理，但在处理Ⅲ和Ⅳ中，第1条带效果清晰，第2条次之，第3条模糊，3条间已相互影响，且拖尾显现逐次加重。
图2表明，每个处理组间提取的DNA含量均较高，3条带在有相互重复的区域都存在拖尾现象，且处理Ⅲ和处理Ⅳ最为严重，第3条带正常的分析已受到影响。对比各处理间的第1条带，差异不大，但随着碱煮时间的延长，每个处理间在第2、第3条带间呈现出拖尾程度不同的现象。当碱煮时间小于3min，即Ⅰ、Ⅱ处理，拖尾不明显，带型分析不受影响;当碱煮时间大于5min时，即Ⅲ、Ⅳ处理，拖尾现象逐条加深，带型分析受到影响。说明了控制碱煮时间是影响DNA提取质量的关键。
分析不同煮沸时间引起的带型差异，利用胚乳进行煮沸快速提取DNA，由于整个提取液中含有多糖、蛋白质、叶绿素等细胞内含物杂质以及一些化学物质，随着煮沸时间的延长，细胞的破损程度增大，内含物的释放量也随之增大，整个提取液及扩增后的产物中含有的杂质也逐渐增多，影响扩增产物的正常电泳，致使多重电泳时，每条带型间相互影响，影响读带的准确性。
2.2 快速提取DNA经稀释后对扩增效果的影响 从图1中发现，提取的DNA浓度过高且每个处理间都存在拖尾现象。在PCR扩增时若DNA含量足够且能降低原液中各种杂质的含量，将能进一步提高电泳谱带的清晰度。进而我们对提取的DNA原液进行稀释1倍处理，重复试验过程，凝胶电泳结果如图3所示。由图3可知，快速提取后的DNA原液经稀释后，不同处理间扩增后电泳谱带的清晰度增加，且拖尾现象不同程度的得到减轻。在处理Ⅰ、Ⅱ中，带型清晰可辨，尤其在Ⅰ中，第3条带依然不受影响。而在处理Ⅲ、Ⅳ中，虽带型的清晰度增加，但没有处理Ⅰ、Ⅱ中明显，依然存在拖尾。说明了提取的DNA原液经稀释后，DNA的含量能够满足SSR试验的需要，且使单位体积内模板中杂质含量减少，电泳后谱带的效果更加清晰。
2.3 快提DNA稀释前后在毛细管检测系统中的应用效果 对试验中处理Ⅰ组的DNA原液分别进行稀释前后的PCR扩增，然后放至毛细管系统中进行电泳，比较效果的差异。图4、5表明，稀释前的DNA经电泳后主峰明显，峰值较高，但存在明显非特异峰;经稀释1倍后主峰较明显，峰值适中，存在非特异性峰但不明显，表明DNA原液稀释后明显的降低了非特异性峰的出现，使主峰更加清晰明辨。同时也证实了处理Ⅰ中提取的DNA可以用于毛细管系统检测，但经稀释后更适合毛细管带型分析。
3 结论与讨论
3.1 控制碱煮时间能有效提高快提法提取DNA的效果 通过切取种子胚乳进行快速提取DNA，能够满足日常检测的需要，这与郭景伦、王风格[3]等的研究一致。通过在沸水中碱煮，能够使细胞迅速破裂[7]，释放出包含DNA在内的一些细胞内含物（多糖、蛋白质等杂质）[8]，为下一步DNA的扩增提供基础，极大地提高了工作效率。但在一般种子企业实验室中，涉及到多重电泳中出现的拖尾问题，为此，本研究设置4种不同的碱煮时间，比较多重电泳后显影的效果。结果表明，在普通的PCR板（96孔，200μL）上碱煮时间3min内提取的DNA，多重电泳后拖尾现象不明显，不影响正常带型分析工作，但碱煮超过5min后，条带间相互影响，拖尾现象严重。
同时，在对DNA原液稀释后再次试验，发现每个处理间的条带清晰度增加，拖尾现象减轻，且碱煮时间在3min内的2组多重电泳后的条带间几乎不受影响。降低杂质含量是解决拖尾现象的关键，碱煮时间越长，细胞内含物的释放越充分，提取的DNA中含有的杂质量越多，扩增及电泳受到的影响就越大。经稀释后，各种杂质的含量比例降低，但DNA的含量仍能达到扩增的需要，最终电泳显影后效果较好。对比分析表明，碱煮的时间长短影响了最终提取DNA的质量，针对普通PCR板，控制碱煮时间3min内，再进行稀释1倍处理，电泳效果最好，不影响日常检测工作的准确性。
3.2 切粒快提法在现代检测仪器中的利用 随着快提法的推广应用，不仅在纯度、一致性及真实性检测上提高了检测效率，而且能够在分子选育上使室内和田间有效的结合，胚没有损伤的种子仍能种到田间观察表现[9]。但随着现代检测仪器毛细管电泳[10]的使用，如高通量检测仪器3730L、ZAG等，使得检测准确率得到了极大的提升，同时也对扩增产物的质量提出了一定的要求。通过切粒沸水碱煮提取DNA，提取液中除了含有一些可溶類杂质外，其中仍含有切除不可溶解的胚或胚乳微粒，致使在扩增时吸取的DNA模板将会含有这些可溶或不可溶物质。由于毛细管电泳仪器的精密性，维护成本较高，结合仪器自身特性，细小的微粒可能会造成毛细管孔堵塞，增大仪器的使用风险。在日常利用毛细管的检测中，尽可能的使用胚芽或叶片进行快提，前人的研究[5]已经证实，发芽3d左右的嫩叶提取的DNA完全满足SSR的要求且适合毛细管系统检测。切粒提取的DNA原液，可以对其进行1～1.5倍的稀释，以降低模板不可溶物质的含量，在不影响检测准确度的基础上，尽量减少毛细管仪器的使用风险。
参考文献
[1]李荣华，夏岩石，刘顺枝，等.改进的CTAB提取植物DNA方法[J].实验室研究与探索，2009，28（9）：14-16.
[2]王艳，李韶山.植物总DNA样品的快速制备[J].激光生物学报，2000，9（1）：79-80.
[3]郭景伦，赵久然，王凤格.适用于SSR分子标记的玉米单粒种子DNA快速提取新方法[J].玉米科学，2005，13（2）：16-17.
[4]郭景伦，王斌.玉米单粒种子DNA提取新方法[J].农业新技术，1997（2）：1-2.
[5]易红梅，张芳，王凤格，等.不同取样方式对DNA快速提取效果的影响[J].华北农学报，2007，22（5）：114-116.
[6]闫燕，许文涛，苏春元，等.平菇基因组DNA提取方法的研究[J].食品工业科技，2011（9）：190-193.
[7]曾乐平，周洪波，黄菊芳.一种经济、简单的微生物基因组DNA的提取方法[J].生态环境学报，2005，14（6）：945-946.
[8]刘泳，杨官品.碱煮法：一种制备海洋浮游生物PCR模板DNA的实用方法[J].海洋科学，2004，28（7）：1-3.
[9]李心平，马福丽，高连兴.玉米种子的机械损伤对其发芽率的影响[J].农机化研究，2009，31（3）：34-35.
[10]戴剑，张云辉.SSR扩增产物检测方法比较及其实验操作注意事项[J].种子，2013，32（9）：120-123.
（责编：张宏民）