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摘 要：本试验利用该基因的电子克隆序列设计了一对引物，通过RT-PCR的方法对IRF6基因进行克隆，并对扩增结果鉴定；以及检测其在各组织中的分布情况。
关键词：IRF6；克隆；RT-PCR；组织分布
IRF6基因由10个外显子组成，第1、10外显子及部分第9外显子不翻译；IRF6由467个氨基酸残基组成。该基因属于转录因子家族，这一家族由9个成员组成，他们的共同点是都由一个高度保守的螺旋—转角—螺旋的DNA结合域和一个相对保守的蛋白质结合域组成的。
大多数IRF基因在病毒感染后调节干扰素和8的表达，对IRF6的功能认识相对落后.J.Knight等分析了小鼠和鸡面部发育时的IRF6基因的表达，结果表明在面部融合形成上唇和原发颚的过程中均有该基因表达，证实了IRF6在唇颚部发育融合过程中起作用。Viera等的研究则认为IRF6与牙齿发育不全关系密切。2006年，Ingraham等建立了IRF6基因敲除的小鼠模型。结果发现，基因敲除的小鼠，其皮肤、四肢和面部均表现异常。组织学和基因表达分析表明，IRF6在调节角质细胞的增值和分化中起了很重要的作用，说明IRF家族在表皮发育过程中有新的功能。实验结果的动物取材为--80℃冰箱保存的肚长大三元猪的各部位组织。取猪的肌肉组织用于目的基因克隆；取猪心、肝、脾、肺、肾、空肠、十二指肠、回肠、脑、肌肉、皮肤、脂肪、胸腺、淋巴结、颌下淋巴结、子宫、睾丸17种组织用于组织分布研究。
一、实验结果与分析
（一）样品中总RNA的检测结果
样品经微量分光光度计定量，所得OD260/OD280值在1.8～2.0之间，表明纯度较好，无蛋白质和DNA污染，实验提取的RNA的纯度可用来合成cDNA。
（二）cDNA扩增
产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，样品在约1400bp处有一条清晰条带，与预期结果相符（见图1）
图1 PCR产物电泳图
M是marker，指标记，1-4指样品
（三）菌液PCR鉴定
按阳性克隆的筛选与鉴定方法进行菌液PCR鉴定，用组织分布的引物做菌液PCR扩增，结果如图2所示。从图2可见，2、3、5、6、7、8号这7个样品在250bp左右处有清晰条带。即2、3、5、6、7、8号有阳性克隆。
图2 菌液PCR电泳图
M是marker，指标记，1-8指样品
（四）猪IRF6的组织分布
采用RT-PCR的方法以β-action 基因为内参在猪的17种组织中研究了IRF6基因在猪不同组织中的表达规律，扩增片段用琼脂糖电泳检测（如图3）。发现IRF6基因在胸腺组织中有较高水平的表达，在心、脾、肺、皮肤、脂肪、淋巴、颌下淋巴、子宫、睾丸组织中表达量相对较少，在肝、肾、空肠、十二指肠、回肠、脑、肌肉组织中不表达。
图3组织分布电泳图
1.心；2.肝；3.脾；4.肺；5.肾；6.空肠；7.十二指肠；8.回肠；9.脑；10.肌肉；
11.皮肤；12.脂肪；13.胸腺；14.淋巴；15.颌下淋巴；16.子宫；17.睾丸
二、讨论IRF6的病理学意义
基因突变可导致常染色体显性遗传的Van der Woude综合征（VWS）或相关的翼状胬肉综合征（PPS）。Van der Woude综合征包括唇腭裂特征和牙齿异常和唇瘘。此外，在IRF6常见等位基因也已通过全基因组关联研究和许多候选基因的研究与唇腭裂的非综合征性有关。这些疾病是由IRF6基因突变引起的一些表型的异质性是由于不同类型的IRF6基因突变。在综合征表型变异的一个解释是基于对二聚化的突变体蛋白的结构差异的影响。VWS出现突变，导致单倍剂量不足而PPS的突变可能是显性负。在VWS和PPS的突变谱最近已总结。IRF6已被证明在角质形成细胞的发育中起着重要的作用。IRF6的功能是与结缔组织的形成有关，例如口感。
三、IRF6基因在各组织中表达的结果及意义
试验采用RT-PCR的方法研究了IRF6基因在猪不同组织中的表达规律。在试验中，IRF6基因在检测的17种组织中分布具有很大的差异性，实验结果表明IRF6基因在在胸腺组织中有较高水平的表达，在心、脾、肺、皮肤、脂肪、淋巴、颌下淋巴、子宫、睾丸组织中表达量相对较少，在肝、肾、空肠、十二指肠、回肠、脑、肌肉组织中不表达。分析试验结果可知，IRF6基因在胸腺组织中表达突出，胸腺为机体的重要淋巴器官，对免疫、分泌胸腺激素及激素类物质有很大的影响，在脾、淋巴、皮肤等组织中均有表达，而淋巴组织构成动物体抵抗病原菌入侵的第二道防线，脾构成第三道防线，这表明IRF6基因有较大可能在猪的免疫防御系统中起着重要作用。另外，该基因在子宫和睾丸中都有一定的表达，这预示着IRF6基因的表达在性腺中无性别差异； 肺是动物的呼吸器官，肝是动物的最大消化腺，并且IRF6基因在猪的肺和肝中都有一定量的表达，这表明IRF6基因有可能在猪的呼吸运动和消化作用的细胞性活动中起着一定的抑制作用； 而在空肠、十二指肠、回肠中不表达，表明IRF6基因对猪消化系统的功能可能并不产生影响。
综上实验结果采用RT-PCR的方法对IRF6进行了基因克隆，并且以β-action基因为内参，在猪的17种组织中研究了IRF6基因在猪不同组织中的表达规律，为进一步分析其生物学功能及其在各组织中的抑制作用奠定了基础，为进一步分析IRF6基因的功能提供了理论依据。
关键词：IRF6；克隆；RT-PCR；组织分布
IRF6基因由10个外显子组成，第1、10外显子及部分第9外显子不翻译；IRF6由467个氨基酸残基组成。该基因属于转录因子家族，这一家族由9个成员组成，他们的共同点是都由一个高度保守的螺旋—转角—螺旋的DNA结合域和一个相对保守的蛋白质结合域组成的。
大多数IRF基因在病毒感染后调节干扰素和8的表达，对IRF6的功能认识相对落后.J.Knight等分析了小鼠和鸡面部发育时的IRF6基因的表达，结果表明在面部融合形成上唇和原发颚的过程中均有该基因表达，证实了IRF6在唇颚部发育融合过程中起作用。Viera等的研究则认为IRF6与牙齿发育不全关系密切。2006年，Ingraham等建立了IRF6基因敲除的小鼠模型。结果发现，基因敲除的小鼠，其皮肤、四肢和面部均表现异常。组织学和基因表达分析表明，IRF6在调节角质细胞的增值和分化中起了很重要的作用，说明IRF家族在表皮发育过程中有新的功能。实验结果的动物取材为--80℃冰箱保存的肚长大三元猪的各部位组织。取猪的肌肉组织用于目的基因克隆；取猪心、肝、脾、肺、肾、空肠、十二指肠、回肠、脑、肌肉、皮肤、脂肪、胸腺、淋巴结、颌下淋巴结、子宫、睾丸17种组织用于组织分布研究。
一、实验结果与分析
（一）样品中总RNA的检测结果
样品经微量分光光度计定量，所得OD260/OD280值在1.8～2.0之间，表明纯度较好，无蛋白质和DNA污染，实验提取的RNA的纯度可用来合成cDNA。
（二）cDNA扩增
产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，样品在约1400bp处有一条清晰条带，与预期结果相符（见图1）
图1 PCR产物电泳图
M是marker，指标记，1-4指样品
（三）菌液PCR鉴定
按阳性克隆的筛选与鉴定方法进行菌液PCR鉴定，用组织分布的引物做菌液PCR扩增，结果如图2所示。从图2可见，2、3、5、6、7、8号这7个样品在250bp左右处有清晰条带。即2、3、5、6、7、8号有阳性克隆。
图2 菌液PCR电泳图
M是marker，指标记，1-8指样品
（四）猪IRF6的组织分布
采用RT-PCR的方法以β-action 基因为内参在猪的17种组织中研究了IRF6基因在猪不同组织中的表达规律，扩增片段用琼脂糖电泳检测（如图3）。发现IRF6基因在胸腺组织中有较高水平的表达，在心、脾、肺、皮肤、脂肪、淋巴、颌下淋巴、子宫、睾丸组织中表达量相对较少，在肝、肾、空肠、十二指肠、回肠、脑、肌肉组织中不表达。
图3组织分布电泳图
1.心；2.肝；3.脾；4.肺；5.肾；6.空肠；7.十二指肠；8.回肠；9.脑；10.肌肉；
11.皮肤；12.脂肪；13.胸腺；14.淋巴；15.颌下淋巴；16.子宫；17.睾丸
二、讨论IRF6的病理学意义
基因突变可导致常染色体显性遗传的Van der Woude综合征（VWS）或相关的翼状胬肉综合征（PPS）。Van der Woude综合征包括唇腭裂特征和牙齿异常和唇瘘。此外，在IRF6常见等位基因也已通过全基因组关联研究和许多候选基因的研究与唇腭裂的非综合征性有关。这些疾病是由IRF6基因突变引起的一些表型的异质性是由于不同类型的IRF6基因突变。在综合征表型变异的一个解释是基于对二聚化的突变体蛋白的结构差异的影响。VWS出现突变，导致单倍剂量不足而PPS的突变可能是显性负。在VWS和PPS的突变谱最近已总结。IRF6已被证明在角质形成细胞的发育中起着重要的作用。IRF6的功能是与结缔组织的形成有关，例如口感。
三、IRF6基因在各组织中表达的结果及意义
试验采用RT-PCR的方法研究了IRF6基因在猪不同组织中的表达规律。在试验中，IRF6基因在检测的17种组织中分布具有很大的差异性，实验结果表明IRF6基因在在胸腺组织中有较高水平的表达，在心、脾、肺、皮肤、脂肪、淋巴、颌下淋巴、子宫、睾丸组织中表达量相对较少，在肝、肾、空肠、十二指肠、回肠、脑、肌肉组织中不表达。分析试验结果可知，IRF6基因在胸腺组织中表达突出，胸腺为机体的重要淋巴器官，对免疫、分泌胸腺激素及激素类物质有很大的影响，在脾、淋巴、皮肤等组织中均有表达，而淋巴组织构成动物体抵抗病原菌入侵的第二道防线，脾构成第三道防线，这表明IRF6基因有较大可能在猪的免疫防御系统中起着重要作用。另外，该基因在子宫和睾丸中都有一定的表达，这预示着IRF6基因的表达在性腺中无性别差异； 肺是动物的呼吸器官，肝是动物的最大消化腺，并且IRF6基因在猪的肺和肝中都有一定量的表达，这表明IRF6基因有可能在猪的呼吸运动和消化作用的细胞性活动中起着一定的抑制作用； 而在空肠、十二指肠、回肠中不表达，表明IRF6基因对猪消化系统的功能可能并不产生影响。
综上实验结果采用RT-PCR的方法对IRF6进行了基因克隆，并且以β-action基因为内参，在猪的17种组织中研究了IRF6基因在猪不同组织中的表达规律，为进一步分析其生物学功能及其在各组织中的抑制作用奠定了基础，为进一步分析IRF6基因的功能提供了理论依据。