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摘要：采用表面增强拉曼光谱方法（surface-enhanced Raman spectroscopy，SERS）结合快速溶剂提取前处理方法快速检测茶叶中多菌灵农药残留。以表面增强试剂为基底，采集不同浓度多菌灵溶液的表面增强拉曼信号；以表面增强试剂为基底，采集以茶叶提取液为基质的不同浓度多菌灵溶液表面增强拉曼信号。结果表明：630、730、1 004、1 221、1 262、1 368、1 462、1 528 cm-1处的拉曼信号较强，可作为多菌灵农药的特征峰；采用SERS方法检测干茶中多菌灵农药的最低检测浓度为2 mg/L，满足国标检测茶叶的要求；选用630 cm-1处的峰强度与多菌灵浓度制定标准曲线，在2～50 mg/L具有良好的线性关系，线性方程为y=15.731x 1 151.9，r2=0.980 2；回收率为86.84%～9240%，相对标准偏差均小于5%，说明本方法有良好的重现率。
关键词：农药残留；多菌灵；表面增强拉曼光谱方法；茶叶；快速检测；回收率；RSD
中图分类号： TQ450.2 63文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0338-02
多菌灵是一种广谱杀菌剂，广泛用于农作物病害的防治。其化学性质稳定，半衰期长，进入人体后，会引起精神恍惚、头昏等中毒症状，影响消费者的健康[1-2]。目前，农药残留常规检测方法有高效液相色谱法（HPLC）、液-质联用法等[3-4]，这些方法存在前处理过程复杂、成本高、检测时间长等缺陷。激光拉曼光谱能得到物质分子振动、转动的信息，拉曼峰位置表明物质的某种基团存在，可用于作为有关试样定性分析的手段。SERS可以对微量样品快速检测，操作简便，已经应用于农产品农药残留的快速检测[5-6]。李晓舟等[7]、张萍等[8]利用SERS建立了食品中农药残留物质的检测方法。本研究以表面增强试剂为基底，利用SERS技术对茶叶中多菌灵农药残留进行定性定量分析。
1材料与方法
1.1试验材料
多菌灵标准品（99%，河北威远生物化工股份有限公司）；乙腈和甲醇（色谱纯，河北冠龙农化有限公司）；表面增强试剂（OTR202、OTR103，欧普图斯光学纳米科技有限公司）；婺源绿茶；硫酸镁、四氧化三铁和石墨化炭（国家标准物质网）。
1.2试验仪器
拉曼光谱仪（Ram Tracer-200-HS，欧普图斯光学纳米科技有限公司）；天平（AR3202CN，精度为0.01 mg，奥豪斯电子天平）；涡旋混合器（Vortex-Genie 2/2T，上海凌初环保仪器有限公司）。
1.3配制多菌灵标准溶液和以茶叶提取液为基质的多菌灵溶液
称取10 mg多菌灵标准品放入100 mL容量瓶中，用甲醇超声溶解，待完全溶解后定容至刻度，得到浓度为100 mg/L的多菌灵标准储备液，用甲醇稀释，分别得到50、20、15、10、8、5、4、2、1、0.5 mg/L的多菌灵溶液；称取5 g茶叶粉末样品，放入50 ml离心管中，加入乙腈10 mL，涡旋振荡1 min，超声提取2 min，以5 000 r/min转速离心5 min，取上清液；取茶叶提取液和100 mg/L的多菌灵标准储备液混合放入15 mL离心管中，涡旋振荡，分别得到50、25、20、16、12、10、8、5、4、3、2、1、0.5 mg/L的以茶叶提取液为基质的多菌灵溶液；将上一步骤中的多菌灵溶液加入自制柱子（石墨化炭、四氧化三铁和硫酸镁按一定比例混合而成）中，混合振荡，以5 000 r/min转速离心5 min，去除色素等物质，取上清液用于检测。
1.4光谱数据采集
以拉曼光谱仪为采集平台，激发波长为785 nm，功率为200 mW，扫描范围400～1 800 cm-1，分辨率为4 cm-1，积分时间为10 s，积分2次求平均，进样瓶中加入500 μL OTR202试剂、20 μL待测液、100 μL OTR103试剂，分别采集多菌灵标准溶液和以茶叶提取液为基质的多菌灵溶液的拉曼光谱。
2结果与分析
2.1多菌灵标准溶液的普通拉曼光谱与表面增强拉曼光谱比较
图1-a是50 mg/L多菌灵标准溶液的表面增强拉曼谱图，图1-b是甲醇溶剂的表面增强拉曼谱图，图1-c是 50 mg/L 多菌灵标准溶液的普通拉曼谱图，从甲醇和多菌灵溶液的表面增强拉曼光谱图可看出，甲醇存在少量SERS峰，但峰强较弱且出峰位置与多菌灵的谱峰不同，表明多菌灵溶液的表面增强拉曼信号不会受到甲醇溶液背景信号的干扰。对比多菌灵溶液的普通拉曼光谱和表面增强拉曼光谱，其普通拉曼谱图中只有单一谱峰，且峰强不高，而多菌灵溶液的表面增强拉曼谱图中的谱峰强度较高且谱峰较多，说明纳米增强试剂能有效增强多菌灵溶液的拉曼信号。图1中630、730、1 004、1 221、1 262、1 368、1 462、1 528 cm-1处的拉曼信号较强，可作为多菌灵农药的特征峰，对这8处特征峰进行谱峰归属[9-10]：630 cm-1归属于C—C—C的面内弯曲振动，730 cm-1归属于苯环中C—H的面外弯曲振动，1 004 cm-1归属于C—O的拉伸振动，1 221 cm-1归属于N—H的面内弯曲振动，1 262 cm-1归属于C—H的面内弯曲振动，1 368 cm-1归属于C—N的伸缩振动，1 462 cm-1归属于—CH3的形变振动，1 528 cm-1归属于C—C的伸缩振动，这些特征谱峰可作为鉴别多菌灵农药的特征峰。
2.2多菌灵标准溶液标准曲线的制定与线性分析
图2为不同浓度多菌灵溶液的表面增强拉曼光谱。由图2可看出，随着多菌灵浓度的减小，其表面增强拉曼信号逐渐减弱，当浓度为1 mg/L时，630、730、1 004、1 221、1 262 cm-1处的拉曼信号依然明显。将630、730、1 004、1 221、1 262 cm-1 处的特征峰强与多菌灵溶液浓度进行线性回归，发现特征峰630 cm-1的峰强与多菌灵溶液浓度有良好的线性关系（图3），线性方程为y=191.55x 2 444.8，r2=0.981 2。 2.3茶叶中多菌灵农药残留分析
图4为含干茶提取液的不同浓度多菌灵甲醇溶液的SERS。
由图4可看出，随着多菌灵浓度的降低，信号强度明显降低，但特征峰的位置几乎没有改变。浓度为5 mg/L时，630 cm-1的拉曼峰非常明显，当浓度为2 mg/L时，630 cm-1的拉曼峰依然明显，当浓度为1 mg/L时，与干茶空白的谱峰类似，未出现多菌灵的拉曼峰，说明采用SERS方法检测干茶中多菌灵农药的最低检测浓度为2 mg/L。国家标准中规定多菌灵在茶叶中的最大残留量为5 mg/L，本方法的最低检测浓度能满足检测要求。
选用630 cm-1处的峰强度与多菌灵浓度制定标准曲线，在2～50 mg/L具有良好的线性关系（图5），线性方程为y=15.731x 1 151.9，r2=0.980 2。
2.4精确度试验分析
使用多菌灵标准溶液和茶叶提取液，分别制备浓度为4.00、12.00、18.00 mg/L的以茶叶提取液为基质的多菌灵溶液，每个样本制作3份平行样本，检测3次，回收率为86.84%～92.40%，RSD均小于5%（表1）。
3结论
研究采用SERS结合快速溶剂提取前处理方法快速检测茶叶中多菌灵农药残留，建立干茶叶中多菌灵农药残留的快
速检测分析方法，确定了多菌灵的表面增强拉曼特征峰：630、730、1 004、1 221、1 262、1 368、1 462、1 528 cm-1。采用SERS方法检测干茶中多菌灵农药的最低检测浓度为2 mg/L，满足国标检测茶叶的要求；选用630 cm-1处的峰强度与多菌灵浓度制定标准曲线，在2～50 mg/L具有良好的线性关系，线性方程为y=15.731x 1 151.9，r2=0.980 2；回收率为 86.84%～92.40%，RSD均小于5%，说明本方法有良好的重现率。该方法前处理简单，整个试验操作在20 min内完成，为检测农产品中农药残留提供了技术支持。
参考文献：
[1]郭爱华，王玮，赵媛媛，等. 高效液相色谱法测定蔬菜中多菌灵的残留量[J]. 中国卫生检验杂志，2014（10）：1407-1410.
[2]张雪波，上官良敏. 茶叶中多菌灵和甲萘威农药残留量的测定[J]. 质量技术监督研究，2009（2）：19-21.
[3]林宏琳，华永有，倪蕾，等. 液-质联用法同时测定食品中罗丹明B和苏丹红染料[J]. 中国卫生检验杂志，2012，22（10）：2302-2304，2307.
[4]陈曦，杨仁斌，董成森，等. 高效液相色谱法测定西瓜及其种植土壤中多菌灵残留的研究[J]. 湖南农业科学，2014（9）：43-46.
[5]Shende C，Inscore F，Sengupta A，et al. Rapid extraction and detection of trace chlorpyrifos-methyl in orange juice by surface-enhanced Raman spectroscopy[J]. Sensing and Instrumentation for Food Quality and Safety，2010，4（3/4）：101-108.
[6]崔淑华，郭庆龙，张峰，等. 气相色谱-质谱法测定花生及制品中17种菊酯类农药残留[J]. 分析化学，2013，41（6）：944-946.
[7]李晓舟，于壮，杨天月，等. SERS技术用于苹果表面有机磷农药残留的检测[J]. 光谱学与光谱分析，2013，33（10）：2711-2714.
[8]张萍，郑大威，刘 晶，等. 基于表面增强拉曼光谱技术的豆芽6-BA残留快速检测方法[J]. 光谱学与光谱分析，2012，32（5）：1266-1269.
[9]刘燕德，叶冰. 基于拉曼光谱技术的氧乐果含量定量分析[J]. 中国农机化学报，2014，35（1）：88-91，102.
[10]王晓彬，吴瑞梅，刘木华，等. 多菌灵农药的激光拉曼光谱分析[J]. 光谱学与光谱分析，2014，34（6）：1566-1570.
关键词：农药残留；多菌灵；表面增强拉曼光谱方法；茶叶；快速检测；回收率；RSD
中图分类号： TQ450.2 63文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0338-02
多菌灵是一种广谱杀菌剂，广泛用于农作物病害的防治。其化学性质稳定，半衰期长，进入人体后，会引起精神恍惚、头昏等中毒症状，影响消费者的健康[1-2]。目前，农药残留常规检测方法有高效液相色谱法（HPLC）、液-质联用法等[3-4]，这些方法存在前处理过程复杂、成本高、检测时间长等缺陷。激光拉曼光谱能得到物质分子振动、转动的信息，拉曼峰位置表明物质的某种基团存在，可用于作为有关试样定性分析的手段。SERS可以对微量样品快速检测，操作简便，已经应用于农产品农药残留的快速检测[5-6]。李晓舟等[7]、张萍等[8]利用SERS建立了食品中农药残留物质的检测方法。本研究以表面增强试剂为基底，利用SERS技术对茶叶中多菌灵农药残留进行定性定量分析。
1材料与方法
1.1试验材料
多菌灵标准品（99%，河北威远生物化工股份有限公司）；乙腈和甲醇（色谱纯，河北冠龙农化有限公司）；表面增强试剂（OTR202、OTR103，欧普图斯光学纳米科技有限公司）；婺源绿茶；硫酸镁、四氧化三铁和石墨化炭（国家标准物质网）。
1.2试验仪器
拉曼光谱仪（Ram Tracer-200-HS，欧普图斯光学纳米科技有限公司）；天平（AR3202CN，精度为0.01 mg，奥豪斯电子天平）；涡旋混合器（Vortex-Genie 2/2T，上海凌初环保仪器有限公司）。
1.3配制多菌灵标准溶液和以茶叶提取液为基质的多菌灵溶液
称取10 mg多菌灵标准品放入100 mL容量瓶中，用甲醇超声溶解，待完全溶解后定容至刻度，得到浓度为100 mg/L的多菌灵标准储备液，用甲醇稀释，分别得到50、20、15、10、8、5、4、2、1、0.5 mg/L的多菌灵溶液；称取5 g茶叶粉末样品，放入50 ml离心管中，加入乙腈10 mL，涡旋振荡1 min，超声提取2 min，以5 000 r/min转速离心5 min，取上清液；取茶叶提取液和100 mg/L的多菌灵标准储备液混合放入15 mL离心管中，涡旋振荡，分别得到50、25、20、16、12、10、8、5、4、3、2、1、0.5 mg/L的以茶叶提取液为基质的多菌灵溶液；将上一步骤中的多菌灵溶液加入自制柱子（石墨化炭、四氧化三铁和硫酸镁按一定比例混合而成）中，混合振荡，以5 000 r/min转速离心5 min，去除色素等物质，取上清液用于检测。
1.4光谱数据采集
以拉曼光谱仪为采集平台，激发波长为785 nm，功率为200 mW，扫描范围400～1 800 cm-1，分辨率为4 cm-1，积分时间为10 s，积分2次求平均，进样瓶中加入500 μL OTR202试剂、20 μL待测液、100 μL OTR103试剂，分别采集多菌灵标准溶液和以茶叶提取液为基质的多菌灵溶液的拉曼光谱。
2结果与分析
2.1多菌灵标准溶液的普通拉曼光谱与表面增强拉曼光谱比较
图1-a是50 mg/L多菌灵标准溶液的表面增强拉曼谱图，图1-b是甲醇溶剂的表面增强拉曼谱图，图1-c是 50 mg/L 多菌灵标准溶液的普通拉曼谱图，从甲醇和多菌灵溶液的表面增强拉曼光谱图可看出，甲醇存在少量SERS峰，但峰强较弱且出峰位置与多菌灵的谱峰不同，表明多菌灵溶液的表面增强拉曼信号不会受到甲醇溶液背景信号的干扰。对比多菌灵溶液的普通拉曼光谱和表面增强拉曼光谱，其普通拉曼谱图中只有单一谱峰，且峰强不高，而多菌灵溶液的表面增强拉曼谱图中的谱峰强度较高且谱峰较多，说明纳米增强试剂能有效增强多菌灵溶液的拉曼信号。图1中630、730、1 004、1 221、1 262、1 368、1 462、1 528 cm-1处的拉曼信号较强，可作为多菌灵农药的特征峰，对这8处特征峰进行谱峰归属[9-10]：630 cm-1归属于C—C—C的面内弯曲振动，730 cm-1归属于苯环中C—H的面外弯曲振动，1 004 cm-1归属于C—O的拉伸振动，1 221 cm-1归属于N—H的面内弯曲振动，1 262 cm-1归属于C—H的面内弯曲振动，1 368 cm-1归属于C—N的伸缩振动，1 462 cm-1归属于—CH3的形变振动，1 528 cm-1归属于C—C的伸缩振动，这些特征谱峰可作为鉴别多菌灵农药的特征峰。
2.2多菌灵标准溶液标准曲线的制定与线性分析
图2为不同浓度多菌灵溶液的表面增强拉曼光谱。由图2可看出，随着多菌灵浓度的减小，其表面增强拉曼信号逐渐减弱，当浓度为1 mg/L时，630、730、1 004、1 221、1 262 cm-1处的拉曼信号依然明显。将630、730、1 004、1 221、1 262 cm-1 处的特征峰强与多菌灵溶液浓度进行线性回归，发现特征峰630 cm-1的峰强与多菌灵溶液浓度有良好的线性关系（图3），线性方程为y=191.55x 2 444.8，r2=0.981 2。 2.3茶叶中多菌灵农药残留分析
图4为含干茶提取液的不同浓度多菌灵甲醇溶液的SERS。
由图4可看出，随着多菌灵浓度的降低，信号强度明显降低，但特征峰的位置几乎没有改变。浓度为5 mg/L时，630 cm-1的拉曼峰非常明显，当浓度为2 mg/L时，630 cm-1的拉曼峰依然明显，当浓度为1 mg/L时，与干茶空白的谱峰类似，未出现多菌灵的拉曼峰，说明采用SERS方法检测干茶中多菌灵农药的最低检测浓度为2 mg/L。国家标准中规定多菌灵在茶叶中的最大残留量为5 mg/L，本方法的最低检测浓度能满足检测要求。
选用630 cm-1处的峰强度与多菌灵浓度制定标准曲线，在2～50 mg/L具有良好的线性关系（图5），线性方程为y=15.731x 1 151.9，r2=0.980 2。
2.4精确度试验分析
使用多菌灵标准溶液和茶叶提取液，分别制备浓度为4.00、12.00、18.00 mg/L的以茶叶提取液为基质的多菌灵溶液，每个样本制作3份平行样本，检测3次，回收率为86.84%～92.40%，RSD均小于5%（表1）。
3结论
研究采用SERS结合快速溶剂提取前处理方法快速检测茶叶中多菌灵农药残留，建立干茶叶中多菌灵农药残留的快
速检测分析方法，确定了多菌灵的表面增强拉曼特征峰：630、730、1 004、1 221、1 262、1 368、1 462、1 528 cm-1。采用SERS方法检测干茶中多菌灵农药的最低检测浓度为2 mg/L，满足国标检测茶叶的要求；选用630 cm-1处的峰强度与多菌灵浓度制定标准曲线，在2～50 mg/L具有良好的线性关系，线性方程为y=15.731x 1 151.9，r2=0.980 2；回收率为 86.84%～92.40%，RSD均小于5%，说明本方法有良好的重现率。该方法前处理简单，整个试验操作在20 min内完成，为检测农产品中农药残留提供了技术支持。
参考文献：
[1]郭爱华，王玮，赵媛媛，等. 高效液相色谱法测定蔬菜中多菌灵的残留量[J]. 中国卫生检验杂志，2014（10）：1407-1410.
[2]张雪波，上官良敏. 茶叶中多菌灵和甲萘威农药残留量的测定[J]. 质量技术监督研究，2009（2）：19-21.
[3]林宏琳，华永有，倪蕾，等. 液-质联用法同时测定食品中罗丹明B和苏丹红染料[J]. 中国卫生检验杂志，2012，22（10）：2302-2304，2307.
[4]陈曦，杨仁斌，董成森，等. 高效液相色谱法测定西瓜及其种植土壤中多菌灵残留的研究[J]. 湖南农业科学，2014（9）：43-46.
[5]Shende C，Inscore F，Sengupta A，et al. Rapid extraction and detection of trace chlorpyrifos-methyl in orange juice by surface-enhanced Raman spectroscopy[J]. Sensing and Instrumentation for Food Quality and Safety，2010，4（3/4）：101-108.
[6]崔淑华，郭庆龙，张峰，等. 气相色谱-质谱法测定花生及制品中17种菊酯类农药残留[J]. 分析化学，2013，41（6）：944-946.
[7]李晓舟，于壮，杨天月，等. SERS技术用于苹果表面有机磷农药残留的检测[J]. 光谱学与光谱分析，2013，33（10）：2711-2714.
[8]张萍，郑大威，刘 晶，等. 基于表面增强拉曼光谱技术的豆芽6-BA残留快速检测方法[J]. 光谱学与光谱分析，2012，32（5）：1266-1269.
[9]刘燕德，叶冰. 基于拉曼光谱技术的氧乐果含量定量分析[J]. 中国农机化学报，2014，35（1）：88-91，102.
[10]王晓彬，吴瑞梅，刘木华，等. 多菌灵农药的激光拉曼光谱分析[J]. 光谱学与光谱分析，2014，34（6）：1566-1570.