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【摘 要】 目的：建立铁甲草中大黄素和齐墩果酸的含量测定方法。方法：采用HPLC法测定铁甲草中齐墩果酸的含量。Waters XBridge Peptide BEH C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相为甲醇-PBS（85∶[KG-*3/5]15），流速1.0 mL/min，柱温35 ℃，进样量为10 μL，检测波长210 nm，测定齐墩果酸的含量。结果：齐墩果酸在5～50 μg/mL的浓度范内呈良好线性关系（Y=4533X+909.6，R=0.9996），平均回收率为99.39%，RSD为1.53%（n=6）。结论：本实验方法准确灵敏、稳定可靠，可用于铁甲草中齐墩果酸的含量测定。
【关键词】 高效液相色谱法;铁甲草;齐墩果酸;含量测定
Abstract：Objective To establish High Performance Liquid Chromatography methods for the determination of the Oleanolic acid in Cassia mimosoides. Methods HPLC methods were used to determine the quantity of the Oleanolic acid in Cassia mimosoides. The Oleanolic acid analysis was performed on a Waters XBridge Peptide BEH C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）with the mobile phase consisting of methyl alcohol-PBS（85∶[KG-*3/5]15） at 210 nm. The flow rate of mobile phase was 1.0 mL/min and injection volume 10 μL at 35 ℃. Results The Oleanolic acid had a good linear relationship in the concentration range of 5～50 μg/mL （Y=4533X+909.6，R=0.9996）. The average recovery was 99.39% and RSD was 1.53%（n=6）. Conclusion The method is accurate， sensitive， stable and reliable. It can be used for the determination of Oleanolic acid in Cassia mimosoides.
Keywords：High Performance Liquid Chromatography; Cassia mimosoides; Oleanolic Acid; Content Determination
鐵甲草（Cassia mimosoides Linn.）为豆科（Leguminousae）决明属一年或多年生亚灌木状草本植物，以全草入药，主要分布于广东、福建、云南、台湾、贵州和广西等地，其味甘、性平，具有清肝明目、散瘀化积的功效[1]。有研究结果表明，铁甲草能够有效抑制脂肪酶，防止脂肪肝[2-3];其主要化学成分有大黄素、齐墩果酸、β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素等[4-5]。然而，目前国内外对铁甲草的研究主要集中在化学成分和药理作用方面，有关铁甲草药材质量控制的研究很少，且未见对其有效成分进行含量测定的报道。本实验以铁甲草中具有抗炎保肝的有效成分齐墩果酸[6]，作为定量检测指标成分，建立铁甲草中齐墩果酸的HPLC含量测定方法，为铁甲草的质量控制和合理开发提供参考依据。
1 仪器与材料
Waters Alliance 2695型高效液相色谱仪（Waters公司）; Waters XBridge Peptide BEH C18（4.6mm×250mm，5μm）; WJX-A1000型高速多功能粉碎机（浙江省永康市红太阳机电有限公司）;JP-100S型超声波清洗器（深圳市洁盟清洗设备有限公司）;MING-CHE 24UV超纯水机（法国Merck Millipore公司）。
齐墩果酸对照品（批号：C1723001），购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;铁甲草采于广东省梅州市蕉岭县，经嘉应学院医学院生药学翟明老师鉴定为豆科决明属植物铁甲草（Cassia mimosoides）的全草;其他试剂均为分析纯。
2 方法及结果
2.1 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸对照品1mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得。
2.2 供试品溶液的制备 称取铁甲草粗粉2g，加入2moL/L的盐酸10mL，充分浸润后，在60℃水浴下，酸水解2h，滤渣用超纯水水洗至中性，干燥后加入10倍量的90%的乙醇溶液和0.5%NaOH溶液，调节pH值至8，50℃超声30 min，抽滤后，水浴加热浓缩成浸膏。
浸膏用甲醇超声溶解后，离心取上清液，定容至10mL，即得。
2.3 色谱条件 色谱柱：Waters XBridge Peptide BEH C18（4.6mm×250mm，5μm）;流动相：甲醇：PBS=85∶[KG-*3/5]15;检测波长：210nm;流速：1.0mL/min;进样量：10μL，柱温：35℃。
2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.1”项下的齐墩果酸对照品0.5、1、2、3、4、5mL溶液于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得浓度为5、10、20、30、40、50μg/mL系列浓度的齐墩果酸对照品溶液，于“2.3”项下的色谱条件，以齐墩果酸对照品溶液色谱峰面积Y为纵坐标，齐墩果酸对照品浓度X（μg/mL）为横坐标，进行线性拟合，得齐墩果酸标准曲线，求得回归方程Y=4533X+909.6，R=0.9996。结果表明，在5～50μg/mL的浓度范围内，齐墩果酸对照品溶液的峰面积与浓度的线性关系良好。 2.5 专属性考察 取项目“2.1”和“2.2”项所制备的对照品溶液和供试品溶液，在“2.3”的色谱条件下进样，齐墩果酸的保留时间约为13.77min，峰型穩定，分离度良好，有较好的基线分离，未见杂质峰干扰，具有良好的专属性。如图1所示。
2.6 仪器精密度试验 精密吸取对照品溶液1.0mL，于“2.3”项的色谱条件下，连续重复进样6次，每次10μL，检测得到大黄素峰面积的RSD为1.36%，表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液1.0mL，分别于0、2、4、6、8、12h于“2.3”项色谱条件下进样，检测得到齐墩果酸的峰面积的RSD为0.82 %。表明供试品溶液在12h内稳定。
2.8 重复性试验 精密称取6份等质量铁甲草粗粉2.00g，按“2.2”项下的方法平行制备6份供试品溶液，于“2.3”项的色谱条件，检测得到齐墩果酸峰面积的RSD为1.47 %。表明该方法重复性良好。
2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的等质量铁甲草粗粉6份，每份2.00g，分别精密加入同一浓度的齐墩果酸对照品，按上述“2.2”的提取方法平行制备成供试品溶液，于“2.3”项色谱条件下测定，计算得到平均回收率结果为99.39%，RSD为1.53%。表明该方法测得的结果有良好准确性。结果见表1。
2.10 样品含量测定 精密称取3份不同批药材各2.00g，按照“2.2”项的制备方法制备成供试品溶液，每份样品分别在“2.3”项的色谱条件下进样三次，记录峰面积，计算样品中齐墩果酸的含量。结果见表2。
3 讨论
在考察齐墩果酸的色谱条件时，曾采用甲醇水，甲醇-0.1%甲酸和甲醇-PBS作为流动相，考察结果显示，当流动相选择为甲醇-PBS（85∶[KG-*3/5]15）时，样品中齐墩果酸分离度更好，峰型稳定，无杂峰干扰。由于齐墩果酸同时含有羟基和羧基基团，在碱性条件下更易被提取，在提取条件的考察过程中，发现加入适量碱溶液使其pH值至8时，更利于齐墩果酸成分的提取。
本实验建立应用高效液相色谱法测定铁甲草中齐墩果酸含量的方法，方法精密度高、稳定性、重复性、加样回收率均符合方法学验证的要求。测得3批样品中，齐墩果酸的含量在3.67% ～3.73%之间，含量较高，且齐墩果酸在临床上主要用于护肝降酶，与铁甲草的功效相符，说明齐墩果酸适合作为铁甲草的质量检测指标成分，该方法可作为铁甲草质量控制的方法，从而为铁甲草质量标准的制订提供参考依据。
参考文献
[1]宋立人， 洪恂， 丁绪亮， 等.现代中药大辞典[M].北京：人民卫生出版社，2001：184.
[2]张纪达，温成平，范永声.铁甲草抑制二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化的实验研究[J].时珍国医国药，2009，20（11）：2879-2881.
[3]李翎，符运舜，林柳青.铁甲草抗大鼠酒精性和四氯化碳慢性肝损伤的作用研究[J].新中医，2015，47（10）：207-208.
[4]韩德凤，杜成林，王晓静.铁甲草化学成分[J].中国实验方剂学杂志，2016，22（7）：78-79.
[5]张纪达，胡英杰，张文，等.铁甲草化学成分的初步研究[J].热带亚热带植物学报，2009，17（1）：80-82.
[6]NYAKUDYA T T， MUKWEVHO E， ERLWANGER K H. The protective effect of neonatal oral administration of oleanolic acid against the subsequent development of fructose-induced metabolic dysfunction in male and female rats[J]. Nutrition Metabolism， 2018， 15（1）：82.
【关键词】 高效液相色谱法;铁甲草;齐墩果酸;含量测定
Abstract：Objective To establish High Performance Liquid Chromatography methods for the determination of the Oleanolic acid in Cassia mimosoides. Methods HPLC methods were used to determine the quantity of the Oleanolic acid in Cassia mimosoides. The Oleanolic acid analysis was performed on a Waters XBridge Peptide BEH C18（250 mm × 4.6 mm，5 μm）with the mobile phase consisting of methyl alcohol-PBS（85∶[KG-*3/5]15） at 210 nm. The flow rate of mobile phase was 1.0 mL/min and injection volume 10 μL at 35 ℃. Results The Oleanolic acid had a good linear relationship in the concentration range of 5～50 μg/mL （Y=4533X+909.6，R=0.9996）. The average recovery was 99.39% and RSD was 1.53%（n=6）. Conclusion The method is accurate， sensitive， stable and reliable. It can be used for the determination of Oleanolic acid in Cassia mimosoides.
Keywords：High Performance Liquid Chromatography; Cassia mimosoides; Oleanolic Acid; Content Determination
鐵甲草（Cassia mimosoides Linn.）为豆科（Leguminousae）决明属一年或多年生亚灌木状草本植物，以全草入药，主要分布于广东、福建、云南、台湾、贵州和广西等地，其味甘、性平，具有清肝明目、散瘀化积的功效[1]。有研究结果表明，铁甲草能够有效抑制脂肪酶，防止脂肪肝[2-3];其主要化学成分有大黄素、齐墩果酸、β-谷甾醇、木犀草素、槲皮素等[4-5]。然而，目前国内外对铁甲草的研究主要集中在化学成分和药理作用方面，有关铁甲草药材质量控制的研究很少，且未见对其有效成分进行含量测定的报道。本实验以铁甲草中具有抗炎保肝的有效成分齐墩果酸[6]，作为定量检测指标成分，建立铁甲草中齐墩果酸的HPLC含量测定方法，为铁甲草的质量控制和合理开发提供参考依据。
1 仪器与材料
Waters Alliance 2695型高效液相色谱仪（Waters公司）; Waters XBridge Peptide BEH C18（4.6mm×250mm，5μm）; WJX-A1000型高速多功能粉碎机（浙江省永康市红太阳机电有限公司）;JP-100S型超声波清洗器（深圳市洁盟清洗设备有限公司）;MING-CHE 24UV超纯水机（法国Merck Millipore公司）。
齐墩果酸对照品（批号：C1723001），购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司;铁甲草采于广东省梅州市蕉岭县，经嘉应学院医学院生药学翟明老师鉴定为豆科决明属植物铁甲草（Cassia mimosoides）的全草;其他试剂均为分析纯。
2 方法及结果
2.1 对照品溶液的制备 精密称取齐墩果酸对照品1mg，置于10mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得。
2.2 供试品溶液的制备 称取铁甲草粗粉2g，加入2moL/L的盐酸10mL，充分浸润后，在60℃水浴下，酸水解2h，滤渣用超纯水水洗至中性，干燥后加入10倍量的90%的乙醇溶液和0.5%NaOH溶液，调节pH值至8，50℃超声30 min，抽滤后，水浴加热浓缩成浸膏。
浸膏用甲醇超声溶解后，离心取上清液，定容至10mL，即得。
2.3 色谱条件 色谱柱：Waters XBridge Peptide BEH C18（4.6mm×250mm，5μm）;流动相：甲醇：PBS=85∶[KG-*3/5]15;检测波长：210nm;流速：1.0mL/min;进样量：10μL，柱温：35℃。
2.4 线性关系考察 分别精密吸取“2.1”项下的齐墩果酸对照品0.5、1、2、3、4、5mL溶液于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得浓度为5、10、20、30、40、50μg/mL系列浓度的齐墩果酸对照品溶液，于“2.3”项下的色谱条件，以齐墩果酸对照品溶液色谱峰面积Y为纵坐标，齐墩果酸对照品浓度X（μg/mL）为横坐标，进行线性拟合，得齐墩果酸标准曲线，求得回归方程Y=4533X+909.6，R=0.9996。结果表明，在5～50μg/mL的浓度范围内，齐墩果酸对照品溶液的峰面积与浓度的线性关系良好。 2.5 专属性考察 取项目“2.1”和“2.2”项所制备的对照品溶液和供试品溶液，在“2.3”的色谱条件下进样，齐墩果酸的保留时间约为13.77min，峰型穩定，分离度良好，有较好的基线分离，未见杂质峰干扰，具有良好的专属性。如图1所示。
2.6 仪器精密度试验 精密吸取对照品溶液1.0mL，于“2.3”项的色谱条件下，连续重复进样6次，每次10μL，检测得到大黄素峰面积的RSD为1.36%，表明仪器精密度良好。
2.7 稳定性试验 精密吸取供试品溶液1.0mL，分别于0、2、4、6、8、12h于“2.3”项色谱条件下进样，检测得到齐墩果酸的峰面积的RSD为0.82 %。表明供试品溶液在12h内稳定。
2.8 重复性试验 精密称取6份等质量铁甲草粗粉2.00g，按“2.2”项下的方法平行制备6份供试品溶液，于“2.3”项的色谱条件，检测得到齐墩果酸峰面积的RSD为1.47 %。表明该方法重复性良好。
2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量的等质量铁甲草粗粉6份，每份2.00g，分别精密加入同一浓度的齐墩果酸对照品，按上述“2.2”的提取方法平行制备成供试品溶液，于“2.3”项色谱条件下测定，计算得到平均回收率结果为99.39%，RSD为1.53%。表明该方法测得的结果有良好准确性。结果见表1。
2.10 样品含量测定 精密称取3份不同批药材各2.00g，按照“2.2”项的制备方法制备成供试品溶液，每份样品分别在“2.3”项的色谱条件下进样三次，记录峰面积，计算样品中齐墩果酸的含量。结果见表2。
3 讨论
在考察齐墩果酸的色谱条件时，曾采用甲醇水，甲醇-0.1%甲酸和甲醇-PBS作为流动相，考察结果显示，当流动相选择为甲醇-PBS（85∶[KG-*3/5]15）时，样品中齐墩果酸分离度更好，峰型稳定，无杂峰干扰。由于齐墩果酸同时含有羟基和羧基基团，在碱性条件下更易被提取，在提取条件的考察过程中，发现加入适量碱溶液使其pH值至8时，更利于齐墩果酸成分的提取。
本实验建立应用高效液相色谱法测定铁甲草中齐墩果酸含量的方法，方法精密度高、稳定性、重复性、加样回收率均符合方法学验证的要求。测得3批样品中，齐墩果酸的含量在3.67% ～3.73%之间，含量较高，且齐墩果酸在临床上主要用于护肝降酶，与铁甲草的功效相符，说明齐墩果酸适合作为铁甲草的质量检测指标成分，该方法可作为铁甲草质量控制的方法，从而为铁甲草质量标准的制订提供参考依据。
参考文献
[1]宋立人， 洪恂， 丁绪亮， 等.现代中药大辞典[M].北京：人民卫生出版社，2001：184.
[2]张纪达，温成平，范永声.铁甲草抑制二甲基亚硝胺诱导大鼠肝纤维化的实验研究[J].时珍国医国药，2009，20（11）：2879-2881.
[3]李翎，符运舜，林柳青.铁甲草抗大鼠酒精性和四氯化碳慢性肝损伤的作用研究[J].新中医，2015，47（10）：207-208.
[4]韩德凤，杜成林，王晓静.铁甲草化学成分[J].中国实验方剂学杂志，2016，22（7）：78-79.
[5]张纪达，胡英杰，张文，等.铁甲草化学成分的初步研究[J].热带亚热带植物学报，2009，17（1）：80-82.
[6]NYAKUDYA T T， MUKWEVHO E， ERLWANGER K H. The protective effect of neonatal oral administration of oleanolic acid against the subsequent development of fructose-induced metabolic dysfunction in male and female rats[J]. Nutrition Metabolism， 2018， 15（1）：82.