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摘 要：苜蓿田长残留除草剂的大量应用，对于后茬作物危害严重，进行苜蓿田根圈土壤长残留除草剂生物降解的研究意义深远。本试验对肇东苜蓿田根圈除草剂生物降解过程中微生物计数培养基的组分和配制方法进行研究，以期为开展苜蓿田长残留除草剂生物降解菌活性成分的提取及应用提供可靠的技术参数和理论依据。
关键词：除草剂；生物降解；微生物；计数培养基
中图分类号 S476+.9 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）08-13-02
苜蓿以“牧草之王”著称，不仅产量高，且草质优良。肇东苜蓿（Medicago sativa L. cv. Zhaodong）为苜蓿属的优良牧草，是20世纪30年代由外地引种到黑龙江省肇东县军马场的紫花苜蓿，在当地栽培多年，后定名为肇东苜蓿，迄今已有80多年的栽培历史[1]。肇东苜蓿植株多为直立，花紫色，颜色有深有浅，叶片大小与叶形不整齐[2]。该品种抗寒性强，无雪或少雪的半干旱地区，在-33℃的低温下仍可露地越冬。在有雪覆盖的大小兴安岭严寒地区，-45℃尚可安全越冬。其丰产性能好，干草产量6.75～10.5t/hm2；适应区域广，宜植区为东北北部、内蒙古东部、新疆、甘肃等地[3]。
由于苜蓿田种植面积的不断扩大和产业化进程的加快，为提高其产量和质量，有效防治病、虫、草害，越来越多的长残留除草剂应用于苜蓿田。自20世纪80年代以来，磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂的使用面积迅速扩大[4]。至20世纪90年代末期，黑龙江省长残留除草剂年销售量（制剂）为：氯嘧磺隆60～70t，咪唑乙烟酸800～1000t，异噁草酮200～300t，氯磺隆20～30t，阿特拉津600～700t[5-6]。长残留除草剂以前所未有的速度进一步发展， 特别是氯嘧磺隆与咪唑乙烟酸已成为苜蓿田难以取代的化学药剂。这种现象将导致后茬敏感作物受害频繁发生，造成苜蓿田减产甚至绝产。面对此种局面，对于苜蓿田根圈土壤长残留除草剂生物降解的研究势在必行且意义重大。本试验拟对肇东苜蓿田根圈除草剂生物降解过程的微生物计数培养基的组分和配制方法进行研究，以期为开展苜蓿田长残留除草剂生物降解菌活性成分的提取及应用提供可靠的技术参数和理论依据。
1 试验材料与设备
1.1 试验材料 试验的材料如下：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、葡萄糖、蒸馏水、淀粉、KH2PO4、MgSO4、KNO3、FeSO4、KNO3、FeSO4·7H2O、K2HPO4等。
1.2 设备 HS-1300-U型水平循环洁净净化工作台（苏州智净净化设备有限公司）、HZQ-C型双层恒温摇床（金坛市顺华仪器有限公司）、干燥箱、电磁炉、高压灭菌锅、分析天平、722型分光光度计、pH计等。
2 土壤微生物计数培养基的组成与配制方法
2.1 除草剂生物降解中的真菌计数培养基
2.1.1 真菌计数培养基的组成 马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基，由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、孟加拉红（玫瑰红，Rose Bengal）及链霉素等组成，具体成分见表1。
2.1.2 真菌计数培养基的配制方法 （1）称量和溶化：按照培养基的配方，准确称取KH2PO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、蛋白胨，并将各成分依次溶于少许蒸馏水中。将孟加拉红配成1%的溶液，量取1%孟加拉红溶液3.3mL，加入培养液中，混匀后，加入16g琼脂，加热溶化。待各成分完全溶化后，补足蒸馏水至1000mL。（2）将配制好的溶液分装、加塞、包扎、高压灭菌。灭菌冷却后，4℃保存备用。（3）抗生素的配制：将链霉素配制成1%的溶液，浓度为100ug/mL。由于抗生素（链霉素）受热容易分解，故临用时，将培养基溶化后待温度降至约45℃时才可加入。
2.2 除草剂生物降解中的细菌计数培养基
2.2.1 细菌计数培养基的组成 牛肉膏、蛋白胨培养基是用来分离细菌的选择性培养基，也是一种应用十分广泛的天然培养基，由牛肉膏、蛋白胨及NaCl等成分组成，具体成分见表2。其中，牛肉膏可为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，NaCl可为微生物提供无机盐。
2.2.2 细菌计数培养基的配制方法 （1）称量和溶化：按照培养基的配方，准确称取牛肉膏、蛋白胨和NaCl，并将各成分依次加入少许蒸馏水中，用玻璃棒搅匀，将烧杯置于火上加热。待各组分溶解后，加入琼脂2g，不断搅拌，以免粘底。琼脂完全溶解后，补足蒸馏水至100mL。（2）调pH值：先用精密pH试纸测量培养液的pH值，如pH值偏酸，则用滴管向培养液中逐滴加入1mol/L的NaOH，边加边搅拌，直至pH值达7.0～7.2。如pH值偏碱性，则用1mol/L的HCl。注意pH值不应调过头，以免回调，否则将影响培养液中各离子的浓度。（3）将配制好的溶液分装、加塞、包扎，121℃、1.05kg/cm2高压蒸汽灭菌20min。灭菌冷却后，置于37℃温室中培养24～48h，检查灭菌是否彻底。
2.3 除草剂生物降解中的放线菌计数培养基
2.3.1 放线菌计数培养基的组成 放线菌计数培养基采用高氏一号培养基，是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。如果加入适量的抗菌药物，则可用来分离各种放线菌。其主要成分包括KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、琼脂、可溶性淀粉以及蒸馏水等，具体成分见表3。
2.3.2 放线菌计数培养基的配制方法 （1）称量和溶化：按照培养基的配方，先称取可溶性淀粉2g，将淀粉调成糊状，再加入少许沸水，置于火上加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后，准确称取KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaCl、琼脂以及FeSO4·7H2O（微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液，按比例换算后加入）。待各组分完全溶解后，补足蒸馏水至100mL。（2）调PH值：先用精密pH试纸测量培养液的pH值，如PH值偏酸，则用滴管向培养液中逐滴加入1mol/L的NaOH，边加边搅拌，直至pH值达7.2～7.4。如pH值偏碱性，则用1mol/L的HCl。注意pH值不应调过头，以免回调，否则将影响培养液中各离子的浓度。（3）将配制好的溶液分装、加塞、包扎，121℃、1.05kg/cm2高压蒸汽灭菌20min。灭菌冷却后，置于37℃温室中培养24～48h，检查灭菌是否彻底。
此合成培养基的主要特点是含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用产生沉淀。因此，混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将两种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。
3 结果与讨论
试验对于肇东苜蓿田根圈土壤微生物计数培养基的配制进行了探讨，包括真菌计数培养基、细菌计数培养基以及放线菌计数培养基的组分和具体的配制方法研究。通过本试验的研究，为长残留除草剂生物降解中土壤微生物计数培养基的配制提供了可靠的组分和技术方法。同时，肇东苜蓿田除草剂生物降解中土壤微生物计数培养基配制的研究成果拟在生产上进行应用，将具有广泛的应用价值和深远的意义，也将为开展苜蓿田长残留除草剂生物降解菌活性成分的提取及应用提供可靠的技术参数和理论依据。
参考文献
[1]梁英辉，穆丹，薛勇. 草甘膦防除肇东苜蓿田菟丝子试验研究[J]. 安徽农学通报，2009，15（18）：124-125.
[2]薛勇，吴玉德，李春丰，等. 肇东苜蓿除草剂安全性试验研究[J].中国农学通报，2006，22（12）：342-344.
[3]梁英辉，穆丹，薛勇，等. 肇东苜蓿田病害种类及发生流行规律调查与综合防治技术试验研究[J]. 消费导刊，2009，（9）：218-219.
[4]戚志强，胡跃高，曾昭海，等. 十四种化学除草剂对沧州地区苜蓿地杂草防效试验[J]. 草原与草坪，2005，（6）：41-44.
[5]叶发兵，王建明，欧阳天贽，等. 磺酰脲类除草剂在土壤中的残留研究动态和趋势[J]. 湖北农业科学，2002，（5）：88-90.
[6]李树春，杨芳，王险峰. 如何预防和解救长残留除草剂药害[J].现代化农业，2010，（10）：34-35. （责编：徐焕斗）
关键词：除草剂；生物降解；微生物；计数培养基
中图分类号 S476+.9 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）08-13-02
苜蓿以“牧草之王”著称，不仅产量高，且草质优良。肇东苜蓿（Medicago sativa L. cv. Zhaodong）为苜蓿属的优良牧草，是20世纪30年代由外地引种到黑龙江省肇东县军马场的紫花苜蓿，在当地栽培多年，后定名为肇东苜蓿，迄今已有80多年的栽培历史[1]。肇东苜蓿植株多为直立，花紫色，颜色有深有浅，叶片大小与叶形不整齐[2]。该品种抗寒性强，无雪或少雪的半干旱地区，在-33℃的低温下仍可露地越冬。在有雪覆盖的大小兴安岭严寒地区，-45℃尚可安全越冬。其丰产性能好，干草产量6.75～10.5t/hm2；适应区域广，宜植区为东北北部、内蒙古东部、新疆、甘肃等地[3]。
由于苜蓿田种植面积的不断扩大和产业化进程的加快，为提高其产量和质量，有效防治病、虫、草害，越来越多的长残留除草剂应用于苜蓿田。自20世纪80年代以来，磺酰脲类和咪唑啉酮类除草剂的使用面积迅速扩大[4]。至20世纪90年代末期，黑龙江省长残留除草剂年销售量（制剂）为：氯嘧磺隆60～70t，咪唑乙烟酸800～1000t，异噁草酮200～300t，氯磺隆20～30t，阿特拉津600～700t[5-6]。长残留除草剂以前所未有的速度进一步发展， 特别是氯嘧磺隆与咪唑乙烟酸已成为苜蓿田难以取代的化学药剂。这种现象将导致后茬敏感作物受害频繁发生，造成苜蓿田减产甚至绝产。面对此种局面，对于苜蓿田根圈土壤长残留除草剂生物降解的研究势在必行且意义重大。本试验拟对肇东苜蓿田根圈除草剂生物降解过程的微生物计数培养基的组分和配制方法进行研究，以期为开展苜蓿田长残留除草剂生物降解菌活性成分的提取及应用提供可靠的技术参数和理论依据。
1 试验材料与设备
1.1 试验材料 试验的材料如下：牛肉膏、蛋白胨、琼脂、葡萄糖、蒸馏水、淀粉、KH2PO4、MgSO4、KNO3、FeSO4、KNO3、FeSO4·7H2O、K2HPO4等。
1.2 设备 HS-1300-U型水平循环洁净净化工作台（苏州智净净化设备有限公司）、HZQ-C型双层恒温摇床（金坛市顺华仪器有限公司）、干燥箱、电磁炉、高压灭菌锅、分析天平、722型分光光度计、pH计等。
2 土壤微生物计数培养基的组成与配制方法
2.1 除草剂生物降解中的真菌计数培养基
2.1.1 真菌计数培养基的组成 马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基，由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、孟加拉红（玫瑰红，Rose Bengal）及链霉素等组成，具体成分见表1。
2.1.2 真菌计数培养基的配制方法 （1）称量和溶化：按照培养基的配方，准确称取KH2PO4、MgSO4·7H2O、葡萄糖、蛋白胨，并将各成分依次溶于少许蒸馏水中。将孟加拉红配成1%的溶液，量取1%孟加拉红溶液3.3mL，加入培养液中，混匀后，加入16g琼脂，加热溶化。待各成分完全溶化后，补足蒸馏水至1000mL。（2）将配制好的溶液分装、加塞、包扎、高压灭菌。灭菌冷却后，4℃保存备用。（3）抗生素的配制：将链霉素配制成1%的溶液，浓度为100ug/mL。由于抗生素（链霉素）受热容易分解，故临用时，将培养基溶化后待温度降至约45℃时才可加入。
2.2 除草剂生物降解中的细菌计数培养基
2.2.1 细菌计数培养基的组成 牛肉膏、蛋白胨培养基是用来分离细菌的选择性培养基，也是一种应用十分广泛的天然培养基，由牛肉膏、蛋白胨及NaCl等成分组成，具体成分见表2。其中，牛肉膏可为微生物提供碳源、磷酸盐和维生素，蛋白胨主要提供氮源和维生素，NaCl可为微生物提供无机盐。
2.2.2 细菌计数培养基的配制方法 （1）称量和溶化：按照培养基的配方，准确称取牛肉膏、蛋白胨和NaCl，并将各成分依次加入少许蒸馏水中，用玻璃棒搅匀，将烧杯置于火上加热。待各组分溶解后，加入琼脂2g，不断搅拌，以免粘底。琼脂完全溶解后，补足蒸馏水至100mL。（2）调pH值：先用精密pH试纸测量培养液的pH值，如pH值偏酸，则用滴管向培养液中逐滴加入1mol/L的NaOH，边加边搅拌，直至pH值达7.0～7.2。如pH值偏碱性，则用1mol/L的HCl。注意pH值不应调过头，以免回调，否则将影响培养液中各离子的浓度。（3）将配制好的溶液分装、加塞、包扎，121℃、1.05kg/cm2高压蒸汽灭菌20min。灭菌冷却后，置于37℃温室中培养24～48h，检查灭菌是否彻底。
2.3 除草剂生物降解中的放线菌计数培养基
2.3.1 放线菌计数培养基的组成 放线菌计数培养基采用高氏一号培养基，是用来培养和观察放线菌形态特征的合成培养基。如果加入适量的抗菌药物，则可用来分离各种放线菌。其主要成分包括KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaCl、FeSO4·7H2O、琼脂、可溶性淀粉以及蒸馏水等，具体成分见表3。
2.3.2 放线菌计数培养基的配制方法 （1）称量和溶化：按照培养基的配方，先称取可溶性淀粉2g，将淀粉调成糊状，再加入少许沸水，置于火上加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后，准确称取KNO3、K2HPO4、MgSO4·7H2O、NaCl、琼脂以及FeSO4·7H2O（微量成分FeSO4·7H2O可先配成高浓度的贮备液，按比例换算后加入）。待各组分完全溶解后，补足蒸馏水至100mL。（2）调PH值：先用精密pH试纸测量培养液的pH值，如PH值偏酸，则用滴管向培养液中逐滴加入1mol/L的NaOH，边加边搅拌，直至pH值达7.2～7.4。如pH值偏碱性，则用1mol/L的HCl。注意pH值不应调过头，以免回调，否则将影响培养液中各离子的浓度。（3）将配制好的溶液分装、加塞、包扎，121℃、1.05kg/cm2高压蒸汽灭菌20min。灭菌冷却后，置于37℃温室中培养24～48h，检查灭菌是否彻底。
此合成培养基的主要特点是含有多种化学成分已知的无机盐，这些无机盐可能相互作用产生沉淀。因此，混合培养基成分时，一般是按配方的顺序依次溶解各成分，甚至有时还需要将两种或多种成分分别灭菌，使用时再按比例混合。
3 结果与讨论
试验对于肇东苜蓿田根圈土壤微生物计数培养基的配制进行了探讨，包括真菌计数培养基、细菌计数培养基以及放线菌计数培养基的组分和具体的配制方法研究。通过本试验的研究，为长残留除草剂生物降解中土壤微生物计数培养基的配制提供了可靠的组分和技术方法。同时，肇东苜蓿田除草剂生物降解中土壤微生物计数培养基配制的研究成果拟在生产上进行应用，将具有广泛的应用价值和深远的意义，也将为开展苜蓿田长残留除草剂生物降解菌活性成分的提取及应用提供可靠的技术参数和理论依据。
参考文献
[1]梁英辉，穆丹，薛勇. 草甘膦防除肇东苜蓿田菟丝子试验研究[J]. 安徽农学通报，2009，15（18）：124-125.
[2]薛勇，吴玉德，李春丰，等. 肇东苜蓿除草剂安全性试验研究[J].中国农学通报，2006，22（12）：342-344.
[3]梁英辉，穆丹，薛勇，等. 肇东苜蓿田病害种类及发生流行规律调查与综合防治技术试验研究[J]. 消费导刊，2009，（9）：218-219.
[4]戚志强，胡跃高，曾昭海，等. 十四种化学除草剂对沧州地区苜蓿地杂草防效试验[J]. 草原与草坪，2005，（6）：41-44.
[5]叶发兵，王建明，欧阳天贽，等. 磺酰脲类除草剂在土壤中的残留研究动态和趋势[J]. 湖北农业科学，2002，（5）：88-90.
[6]李树春，杨芳，王险峰. 如何预防和解救长残留除草剂药害[J].现代化农业，2010，（10）：34-35. （责编：徐焕斗）