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摘 要：本研究应用盐霉素单克隆抗体研制出一种能够检测动物源性食品中盐霉素的胶体金免疫层析试纸条，检测限为20μg/kg，检测时间仅为15min，假阳性率和假阴性率均为0，符合《兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序》的要求。该试纸条能够应用于基层实验室的大批量样本检测，具有实际意义，并且未见免疫方法相关文献报道，具有创新性。
关键词：盐霉素 胶体金免疫层析试纸条 快速检测
引言
盐霉素属于聚醚类抗生素，不仅常用于防治鸡、猪等畜禽的球虫病，还能作为猪等家畜的生长促进剂。为牟取更高收益，不良畜牧业主会过量使用盐霉素，导致动物源性食品中的盐霉素超标，进而影响人类健康。因此，检测动物源性食品中的盐霉素具有必要性。目前，检测盐霉素的方法主要有高效液相色谱柱后衍生化法、UPLC-MS/MS法、液相色谱-电喷雾串联质谱法等仪器方法[1-6]，但鲜有快速检测方法。上述仪器检测方法耗时较长，单台仪器成本在百万元以上，难以用于基础实验室的检测工作。胶体金免疫层析试纸条属于快速检测方法，检测时间小于30min，试纸条成本几元至几十元不等，非常适合基层实验室的大批量检测工作。本研究开发了一种检测盐霉素的胶体金免疫层析试纸条，其能够检测动物源性食品中的盐霉素抗生素残留，实际应用价值较高。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
盐霉素、马杜霉素、红霉素、泰乐菌素、莫能菌素等标准品（纯度≥95%），购自北京标准物质研究中心;氯金酸（HAuCl4·3H2O），购自美国Sigma公司;柠檬酸三钠，购自北京百欣试剂公司。
1.2 方法
1.2.1 胶体金的制备
取0.01%氯金酸水溶液100mL加热至沸腾;一边搅拌，一边准确加入1%柠檬酸三钠溶液1.5mL;待氯金酸水溶液变为酒红色，继续煮沸15min，冷却后于4℃避光保存[7-10]。
1.2.2 盐霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下，用0.2mol/L Na2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至7.2，每毫升胶体金溶液中加入50μg盐霉素单克隆抗体，混匀，静置10min，加入10%BSA，使其在胶体金溶液中的体积百分含量为1%，静置10min。然后离心、洗涤、重悬，置于4℃备用[7-10]。
1.2.3 结合物释放垫的制备
将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.5%）、pH值7.2、0.5mol/L的磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用Isoflow点膜仪将制备好的盐霉素单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01mL盐霉素单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中（湿度<20%）60min后取出，置于干燥环境（湿度<20%）中保存备用[7-10]。
1.2.4 反应膜的制备
将盐霉素包被原包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线[7-10]。
包被过程：用磷酸缓冲液将盐霉素包被原稀释至10mg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T线），包被量为0.8μL/cm;用0.01mol/L、pH值7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C线），包被量为1.0μL/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用[7-10]。
1.2.5 样品吸收垫的制备
将样品吸收垫置于含0.5%牛血清白蛋白（体积分数）、pH值7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h，备用[7-10]。
1.2.6 检测方法
用吸管吸取70μL待检样品溶液垂直滴加于加样孔中，液体流动时开始计时，反应5～10min，根据示意图判定结果或通过胶体金分析仪读取检测结果，其它时间判读无效[7-10]。
1.2.7 样本检测限
在空白鸡肉、猪肉等动物源性食品样本中分别添加盐霉素标准品至质量浓度为0、10、15、20、25、30μg/L，按照“1.2.6”所述方法用3批试纸条进行检测，每个浓度重复5次，根据实验结果确定样本检测限[9-10]。
1.2.8 试纸条的特异性
分别配制500μg/L的马杜霉素、红霉素、泰乐菌素、莫能菌素等药物，用该试纸条检测，重复3次，判断试纸条的特异性。
1.2.9 试纸条的准确性
农业部文件要求，以假阳性率和假阴性率表示胶体金免疫层析法的准确性。取经仪器確证的50份阴性鸡肉、猪肉等动物源性食品样品（质量浓度小于20μg/kg），50份阳性鸡肉、猪肉等动物源性食品样品（质量浓度大于20μg/kg），然后用该试纸条进行盐霉素药物残留检测，计算假阳性率和假阴性率。《兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序》规定：试纸条假阳性率应小于5%，假阴性率应为零[9-10]。
1.2.10 试纸条的稳定性
将试纸条保存于2～8℃环境中，每隔1个月检测试纸条的准确性，连续测定15个月。具体方法为：分别检测经仪器确证的20份阴性鸡肉、猪肉动物源性食品样品（质量浓度小于20μg/kg），20份阳性鸡肉、猪肉动物源性食品样品（质量浓度大于20μg/kg），重复测定2次，然后根据实验结果判定试纸条的稳定性[9-10]。
2 结果与分析
2.1 胶体金的鉴定
肉眼观察制备的胶体金，其颜色为酒红色、均匀度较好、无杂质、透明度较高。取冷却后的胶体金溶液在透射电镜下观察胶体金颗粒的均一程度，并测量金颗粒粒径。经透射电镜观察，胶体金颗粒分布比较均匀，金颗粒的粒径约为20nm[9-10]。 2.2 样本检测限
配置盐霉素浓度分别为0、10、15、20、25、30μg/L的鸡肉、猪肉动物源性食品样品，按照“1.2.7”所述步骤进行检测，确定检测限。该试纸条的检测限为20μg/kg，见表1、图3、图4。
2.3 特异性
使用试纸条检测500μg/L的马杜霉素、红霉素、泰乐菌素、莫能菌素等药物，结果均呈阴性，表明该试纸条特异性较好。
2.4 准确性
用试纸条检测50份阴性动物源性食品样品，检测结果均为阴性，说明假阳性率低于5%;用试纸条检测50份阳性动物源性食品样品，试纸条检测结果均为阳性，说明试纸条假阴性率为零，符合《兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序》的要求。
2.5 稳定性
12个月内，试纸条的假阳性率和假阴性率均符合要求，从第14个月起，试纸条会出现少量失效或假阳性等现象。
3 讨论
目前，有关应用快速检测方法检测盐霉素的文献非常有限，本文制备出一种商品化的胶体金免疫层析试纸条，并按照《兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序》的要求对试纸条进行了特异性、准确性、稳定性等性能测试，均符合要求。该试纸条的检测时间仅为15min，比现有文献中的仪器方法用时更短，操作更简便;检测限为20μg/kg，且未见免疫方法相关文献报道。
参考文献：
[1] 王雅娟，张杨杨，郭亚文，谢恺舟，赵霞，卜晓娜，刘楚君.动物源性食品中抗球虫药物残留的色谱和质谱检测技术研究进展[J].中国兽医学报，2018，38（12）：2424-2431.
[2] 刘建宇.鸡蛋、鸡肌肉和牛肉中八种抗球虫药物残留液相色谱串联质谱确证分析方法的研究[D].扬州大学，2016.
[3] 张素霞，沈建忠，吕亚滨，黄智珍.莫能菌素和盐霉素在鸡组织中的残留分析方法研究[J].畜牧兽医学报，2000（06）：530-535.
[4] 马立农，陈杖榴.高效液相色谱柱前衍生化法测定饲料中的盐霉素[J].中国兽药杂志，2002（02）：33-35.
[5] 李娜，祁克宗，朱良强，孙洁，施祖灏，卢运战，陈曦.聚醚类抗生素残留检测方法的研究进展[J].家禽科学，2007（05）：38-40.
[6] 曹亚青，宋歌，王曼曼，王学生，艾连峰.TurboFlow在线净化/液相色谱-串联质谱法快速测定动物源性食品中聚醚类抗生素的研究[J].分析测试学报，2016，35（10）：1273-1277.
[7] 孙翠萍，万宇平，王效东，马长旺，钱宏光.黄曲霉毒素M1胶体金快速检测试纸条的研制[J].《吉林畜牧兽医，2013，34（01）：19-21》.
[8] 萬宇平，何方洋，贾芳芳，崔娜，崔海峰，郑百芹.一种滴滴涕胶体金免疫快速检测试纸条的研制[J].《食品安全导刊》，2020（28）：54-57.
[9] 吴小胜，贾芳芳，崔海峰，王兆芹，魏力杰，崔娜，赵正苗，万宇平.一种苯醚氰菊酯胶体金免疫快速检测试纸条的研制[J].湖北农业科学，2020，59（07）：196-198+203.
[10] 朱亮亮，王琳琛，王兆芹，崔海峰，张坤，冯才伟，万宇平.检测4种有机磷农药胶体金免疫层析试纸条的研制[J].山东畜牧兽医，2019，40（08）：10-12.
关键词：盐霉素 胶体金免疫层析试纸条 快速检测
引言
盐霉素属于聚醚类抗生素，不仅常用于防治鸡、猪等畜禽的球虫病，还能作为猪等家畜的生长促进剂。为牟取更高收益，不良畜牧业主会过量使用盐霉素，导致动物源性食品中的盐霉素超标，进而影响人类健康。因此，检测动物源性食品中的盐霉素具有必要性。目前，检测盐霉素的方法主要有高效液相色谱柱后衍生化法、UPLC-MS/MS法、液相色谱-电喷雾串联质谱法等仪器方法[1-6]，但鲜有快速检测方法。上述仪器检测方法耗时较长，单台仪器成本在百万元以上，难以用于基础实验室的检测工作。胶体金免疫层析试纸条属于快速检测方法，检测时间小于30min，试纸条成本几元至几十元不等，非常适合基层实验室的大批量检测工作。本研究开发了一种检测盐霉素的胶体金免疫层析试纸条，其能够检测动物源性食品中的盐霉素抗生素残留，实际应用价值较高。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
盐霉素、马杜霉素、红霉素、泰乐菌素、莫能菌素等标准品（纯度≥95%），购自北京标准物质研究中心;氯金酸（HAuCl4·3H2O），购自美国Sigma公司;柠檬酸三钠，购自北京百欣试剂公司。
1.2 方法
1.2.1 胶体金的制备
取0.01%氯金酸水溶液100mL加热至沸腾;一边搅拌，一边准确加入1%柠檬酸三钠溶液1.5mL;待氯金酸水溶液变为酒红色，继续煮沸15min，冷却后于4℃避光保存[7-10]。
1.2.2 盐霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备
在磁力搅拌下，用0.2mol/L Na2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至7.2，每毫升胶体金溶液中加入50μg盐霉素单克隆抗体，混匀，静置10min，加入10%BSA，使其在胶体金溶液中的体积百分含量为1%，静置10min。然后离心、洗涤、重悬，置于4℃备用[7-10]。
1.2.3 结合物释放垫的制备
将结合物释放垫浸泡于含有牛血清白蛋白（牛血清白蛋白在缓冲液中的浓度为0.5%）、pH值7.2、0.5mol/L的磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿1h，37℃烘3h备用。用Isoflow点膜仪将制备好的盐霉素单克隆抗体-胶体金标记物均匀喷涂在结合物释放垫上，每1cm结合物释放垫喷涂0.01mL盐霉素单克隆抗体-胶体金标记物后，置于37℃环境中（湿度<20%）60min后取出，置于干燥环境（湿度<20%）中保存备用[7-10]。
1.2.4 反应膜的制备
将盐霉素包被原包被到反应膜上构成检测线，将羊抗鼠抗抗体包被在反应膜上构成质控线[7-10]。
包被过程：用磷酸缓冲液将盐霉素包被原稀释至10mg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线（T线），包被量为0.8μL/cm;用0.01mol/L、pH值7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠抗抗体稀释到200μg/mL，用Isoflow点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线（C线），包被量为1.0μL/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h，备用[7-10]。
1.2.5 样品吸收垫的制备
将样品吸收垫置于含0.5%牛血清白蛋白（体积分数）、pH值7.2、0.1mol/L的磷酸盐缓冲液中浸泡2h，37℃烘2h，备用[7-10]。
1.2.6 检测方法
用吸管吸取70μL待检样品溶液垂直滴加于加样孔中，液体流动时开始计时，反应5～10min，根据示意图判定结果或通过胶体金分析仪读取检测结果，其它时间判读无效[7-10]。
1.2.7 样本检测限
在空白鸡肉、猪肉等动物源性食品样本中分别添加盐霉素标准品至质量浓度为0、10、15、20、25、30μg/L，按照“1.2.6”所述方法用3批试纸条进行检测，每个浓度重复5次，根据实验结果确定样本检测限[9-10]。
1.2.8 试纸条的特异性
分别配制500μg/L的马杜霉素、红霉素、泰乐菌素、莫能菌素等药物，用该试纸条检测，重复3次，判断试纸条的特异性。
1.2.9 试纸条的准确性
农业部文件要求，以假阳性率和假阴性率表示胶体金免疫层析法的准确性。取经仪器確证的50份阴性鸡肉、猪肉等动物源性食品样品（质量浓度小于20μg/kg），50份阳性鸡肉、猪肉等动物源性食品样品（质量浓度大于20μg/kg），然后用该试纸条进行盐霉素药物残留检测，计算假阳性率和假阴性率。《兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序》规定：试纸条假阳性率应小于5%，假阴性率应为零[9-10]。
1.2.10 试纸条的稳定性
将试纸条保存于2～8℃环境中，每隔1个月检测试纸条的准确性，连续测定15个月。具体方法为：分别检测经仪器确证的20份阴性鸡肉、猪肉动物源性食品样品（质量浓度小于20μg/kg），20份阳性鸡肉、猪肉动物源性食品样品（质量浓度大于20μg/kg），重复测定2次，然后根据实验结果判定试纸条的稳定性[9-10]。
2 结果与分析
2.1 胶体金的鉴定
肉眼观察制备的胶体金，其颜色为酒红色、均匀度较好、无杂质、透明度较高。取冷却后的胶体金溶液在透射电镜下观察胶体金颗粒的均一程度，并测量金颗粒粒径。经透射电镜观察，胶体金颗粒分布比较均匀，金颗粒的粒径约为20nm[9-10]。 2.2 样本检测限
配置盐霉素浓度分别为0、10、15、20、25、30μg/L的鸡肉、猪肉动物源性食品样品，按照“1.2.7”所述步骤进行检测，确定检测限。该试纸条的检测限为20μg/kg，见表1、图3、图4。
2.3 特异性
使用试纸条检测500μg/L的马杜霉素、红霉素、泰乐菌素、莫能菌素等药物，结果均呈阴性，表明该试纸条特异性较好。
2.4 准确性
用试纸条检测50份阴性动物源性食品样品，检测结果均为阴性，说明假阳性率低于5%;用试纸条检测50份阳性动物源性食品样品，试纸条检测结果均为阳性，说明试纸条假阴性率为零，符合《兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序》的要求。
2.5 稳定性
12个月内，试纸条的假阳性率和假阴性率均符合要求，从第14个月起，试纸条会出现少量失效或假阳性等现象。
3 讨论
目前，有关应用快速检测方法检测盐霉素的文献非常有限，本文制备出一种商品化的胶体金免疫层析试纸条，并按照《兽药残留检测试剂盒（条、卡）备案技术资料要求及审查工作程序》的要求对试纸条进行了特异性、准确性、稳定性等性能测试，均符合要求。该试纸条的检测时间仅为15min，比现有文献中的仪器方法用时更短，操作更简便;检测限为20μg/kg，且未见免疫方法相关文献报道。
参考文献：
[1] 王雅娟，张杨杨，郭亚文，谢恺舟，赵霞，卜晓娜，刘楚君.动物源性食品中抗球虫药物残留的色谱和质谱检测技术研究进展[J].中国兽医学报，2018，38（12）：2424-2431.
[2] 刘建宇.鸡蛋、鸡肌肉和牛肉中八种抗球虫药物残留液相色谱串联质谱确证分析方法的研究[D].扬州大学，2016.
[3] 张素霞，沈建忠，吕亚滨，黄智珍.莫能菌素和盐霉素在鸡组织中的残留分析方法研究[J].畜牧兽医学报，2000（06）：530-535.
[4] 马立农，陈杖榴.高效液相色谱柱前衍生化法测定饲料中的盐霉素[J].中国兽药杂志，2002（02）：33-35.
[5] 李娜，祁克宗，朱良强，孙洁，施祖灏，卢运战，陈曦.聚醚类抗生素残留检测方法的研究进展[J].家禽科学，2007（05）：38-40.
[6] 曹亚青，宋歌，王曼曼，王学生，艾连峰.TurboFlow在线净化/液相色谱-串联质谱法快速测定动物源性食品中聚醚类抗生素的研究[J].分析测试学报，2016，35（10）：1273-1277.
[7] 孙翠萍，万宇平，王效东，马长旺，钱宏光.黄曲霉毒素M1胶体金快速检测试纸条的研制[J].《吉林畜牧兽医，2013，34（01）：19-21》.
[8] 萬宇平，何方洋，贾芳芳，崔娜，崔海峰，郑百芹.一种滴滴涕胶体金免疫快速检测试纸条的研制[J].《食品安全导刊》，2020（28）：54-57.
[9] 吴小胜，贾芳芳，崔海峰，王兆芹，魏力杰，崔娜，赵正苗，万宇平.一种苯醚氰菊酯胶体金免疫快速检测试纸条的研制[J].湖北农业科学，2020，59（07）：196-198+203.
[10] 朱亮亮，王琳琛，王兆芹，崔海峰，张坤，冯才伟，万宇平.检测4种有机磷农药胶体金免疫层析试纸条的研制[J].山东畜牧兽医，2019，40（08）：10-12.