【摘 要】
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糖基转移酶(Glycosyltransferases,GTs)作为催化糖链合成的工具酶,在酶法或化学酶法合成糖缀复合物和寡糖技术体系发挥重要作用.优良催化特性GT工具酶的缺乏,是制约化学
【机 构】
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山东大学药学院生化与生物技术药物研究所
【出 处】
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2015中国酶工程与糖生物工程学术研讨会
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糖基转移酶(Glycosyltransferases,GTs)作为催化糖链合成的工具酶,在酶法或化学酶法合成糖缀复合物和寡糖技术体系发挥重要作用.优良催化特性GT工具酶的缺乏,是制约化学酶法规模化制备活性糖缀复合物的瓶颈问题之一.发现全新的天然GT,或者利用蛋白质工程改造已有GT是突破这一瓶颈问题的有效手段.分子定向进化(molecular directed evolution)属于蛋白质工程中的非理性设计范畴,是指建立在体外模拟自然进化过程基础上的由人工突变基因而达到操纵蛋白质结构和性质的过程.灵敏、准确的高通量筛选系统是GT分子定向进化策略能够实施的两大必要条件之一.本课题组建立了偶联酿酒酵母UDP水解酶的Leloir型GT反应高通量筛选体系.首先,通过对S.cerevisiae UDP水解酶YND1(yeast nucleoside diphosphatase, YND1, GenBank： NC_001137.3 REGION： 160550.162442,SGD ID：S000000807)特定跨膜区域的理性突变,实现YND1在大肠杆菌中的可溶性重组表达.将Leloir型GT反应与重组YND1对nucleoside diphosphate (NDP)水解活性的偶联,通过对"两步"反应产物(游离硫酸根)的特异性检测,建立了一个Leloir型GT高通量检测体系.此外,以大肠杆菌肝素骨架合成酶KfiA为模式酶分子,初步验证了偶联YND1对化学酶法寡糖合成步骤的效率有明显的促进作用.
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