【摘 要】
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(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸是神经病理性疼痛和癫痫治疗首选药物普瑞巴林的关键手性中间体.本研究通过基因挖掘,从疏绵状嗜热丝孢菌基因组中获得一个能够高选择性
【机 构】
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浙江工业大学生物工程研究所,浙江杭州,310032
【出 处】
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2015中国酶工程与糖生物工程学术研讨会
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(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸是神经病理性疼痛和癫痫治疗首选药物普瑞巴林的关键手性中间体.本研究通过基因挖掘,从疏绵状嗜热丝孢菌基因组中获得一个能够高选择性拆分外消旋2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸乙酯(CNDE)合成(3S)-2-羧乙基-3-氰基-5-甲基己酸的脂肪酶Lip.为了提高Lip对CNDE的水解活力,开展了Lip的分子改造研究.首先选择脂肪酶盖子结构附近及氧负离子洞组成氨基酸为突变位点.通过多轮点饱和突变,从突变库中筛选到活力明显提高的突变体S88T/A99N/V 116D,其活力(2.35 U/mg)是野生型Lip的60.3倍,与TLL (2.40 U/mg,从Lipolase(R)中纯化)相当,并分析了突变体活力提高的机理.随后,以定点饱和突变获得的突变体Lip-T (S88T/A99N/V116D)为亲本,利用易错PCR构建随机突变库,筛选到突变体S63L/D232A,其活力是亲本Lip-T的2.0倍.为了明确这两个点突变在活力提高中的作用,利用定点突变技术分别构建单点突变体S63L和D232A,发现S63L和D232A突变对酶活的影响截然相反：S63L能有效提高酶活,单突变体S63L的活力是双突变体S63L/D232A的1.5倍；而D232A突变引起活力的降低,其活力仅为亲本的68％.为考察其它18种氨基酸替换对活力的影响,分别构建了位点63和232的饱和突变文库,并筛选到活力更高的突变体S63M/S88T/A99N/V116D,其活力达到8.68 U/mg,为S88T/A99N/V 116D的3.7倍,TLL的3.6倍,野生型Lip的222.6倍.表达突变体S63M/S88T/A99N/V 116D的大肠杆菌细胞(5％,w/v)能高效催化3 M(765 g/L)CNDE选择性水解,反应24 h,转化率45.2％,ee值98％,在催化剂使用量更少的情况下,已达到Lipolase(R) (8％,w/v)拆分CNDE的水平.
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