【摘 要】
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目的 生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45(GADD45)基因家族位于p53下游,是DNA损伤修复的重要相关基因.为检测环境中可能存在的致癌物,建立GADD45a双荧光素报告基因系统,本实验构建了人GADD45a荧光素酶报告基因质粒.方法 以人Hep-G2培养细胞基因组DNA为模板,在涵盖GADD45a基因启动子序列2.3k及基因组DNA序列2.6k(包括3个内含子和4个外显子)范围内,分别以三对引物
【机 构】
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中国检验检疫科学研究院国家质检总局毒理重点实验室,北京100123
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目的 生长阻滞和DNA损伤诱生蛋白45(GADD45)基因家族位于p53下游,是DNA损伤修复的重要相关基因.为检测环境中可能存在的致癌物,建立GADD45a双荧光素报告基因系统,本实验构建了人GADD45a荧光素酶报告基因质粒.方法 以人Hep-G2培养细胞基因组DNA为模板,在涵盖GADD45a基因启动子序列2.3k及基因组DNA序列2.6k(包括3个内含子和4个外显子)范围内,分别以三对引物进行扩增：CCGCTCGAGATAGCATGCAGTATAATTTTTGAGT(GD2.3K-sens1)/TTAAAAAAGTGTCTCCAGACCTC(GD2.3K-anti1),CAGCTTTCCAAAAATAAATCAAAC(GD2.3K-sens2)/CAGCGTCGGTCTCCAAGAG(GD2.3K-anti2), CACTTCCTGTCGCTTTTCTG(GD2.3K-sens3)/GAAGATCTTCAGGGAGATTAATCACTGGAAC(GD2.3 K-anti3),扩增片段大小分别为1890,1925,1558 bp.然后以三条扩增片段产物为模板,以GD 2.3k-sens1/GD2.3K-anti3为引物进行搭桥PCR,获得全长为4924 bp的目的序列.序列回收后,通过TA克隆构建到载体pMD18-T内,为质粒pMD-GD 2.3 k,经Xho Ⅰ及BgⅢ酶切后插入pGL4.10[luc2]质粒相应位点内.质粒构建成功后测定全长并进行酶切鉴定.结果 质粒全长测定及酶切鉴定结果显示,利用搭桥PCR方法,正确扩增了全长为4.9k的人GADD45a基因片段,成功构建了人GADD45a-GL4.10[luc2]报告基因质粒.结论 在扩增大片段DNA序列的时候,应用搭桥PCR方法可以比较轻松地得到全长序列.通过设计三对引物扩增中等大小的片段,之后经搭桥PCR得到将近5k的目的序列,顺利构建了人GADD45a-GL4.10[luc2]报告基因质粒.
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