【摘 要】
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为了研究高效广谱的基因工程抗病毒制剂,本研究设计引物自猪肝脏总DNA扩增、克隆猪α干扰素(PoIFN-α)成熟肽基因并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪α干扰素(rPoIFN-α)蛋白通过尿素变性,低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用细胞病变抑制法分别测定rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗水泡性口炎病毒(VSV)增殖活性及在Marc-145细胞上抑制高致
【机 构】
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河南省动物疫病预防控制中心, 河南 郑州 450008
【出 处】
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中国畜牧兽医学会动物传染病学分会第三届猪病防控学术研讨会
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为了研究高效广谱的基因工程抗病毒制剂,本研究设计引物自猪肝脏总DNA扩增、克隆猪α干扰素(PoIFN-α)成熟肽基因并亚克隆入pQE30载体进行原核表达,对表达的融合重组猪α干扰素(rPoIFN-α)蛋白通过尿素变性,低浓度蛋白复性液复性、PBS溶液透析等步骤进行纯化,采用细胞病变抑制法分别测定rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗水泡性口炎病毒(VSV)增殖活性及在Marc-145细胞上抑制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)的增殖活性以分别评价rPoIFN-α的活性单位及其体外抑制高致病性PRRSV增殖所需的最低浓度.结果表明,成功克隆了PoIFN-α成熟肽基因,基因全长501bp,编码166个氨基酸;表达的rPoIFN-α蛋白分子量大小20.7 Ku左右,与预期大小相一致:经纯化后的蛋白纯度在95％以上:纯化的rPoIFN-α蛋白在PK15细胞上抗VSV病毒活性单位为1.4482×104 IU/mL(5.2×106 IU/mg),在Marc-145细胞上能完全抑制高致病性PRRSV增殖所需的rPoIFN-α蛋白最低有效量为640 U/mL(2.3×104 U/mg).本研究成功表达了具有抗病毒活性的PoIFN-α蛋白,这些研究为新型基因工程抗病毒制剂的开发以及高致病性猪繁殖与呼吸综合征等病毒性疾病的预防和治疗奠定了基础.
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实验以人工诱导的耐药菌株和临床分离的猪源耐药大肠杆菌Fj307为主要材料,以大肠杆菌AcrAB-TolC外排系统中AcrA蛋白为干扰目标设计RNAi实验,从表观水平检测了特异性siRNA对耐药菌YD02的抑制能力:结果显示,siRNA_164实验组使耐药菌吸光度降低到对照的1/4,差异极显著,说明siRNA_164能够造成大肠杆菌耐药性的逆转.实验使用了4个针对TolC蛋白设计合成的吲哚类外排泵抑
应用酶联免疫吸附试验(ELISA)方法和细菌分离鉴定,对湖南省9个市33个猪场的631份血清样品和126份病死猪内脏组织样品进行猪 2型链球菌血清学调查和细菌分离鉴定,结果血清中猪2型链球菌的抗体阳性率为48.0％,所调查的9个市均有不同程度的阳性,84.8％的猪场检出阳性抗体,不同日龄猪群阳性率分别为:种猪65.2％,肥猪51.3％、中猪39.8％、小猪25.2％,健康猪群与发病猪群抗体阳性率分
2007年4月,龙岩市某存栏母猪达200头的规模化猪场,保育栏仔猪出现体温升高,呼吸困难,咳嗽,耳、鼻端、四肢及下腹部皮肤发紫.经临床剖检及病理观察大体判断为圆环病毒与蓝耳病混合感染,为进一步确诊,进行了实验室诊断.分别设计了PCV2及PRRSV的扩增引物,结果从病例中扩增出相应的产物.通过临床、病理及实验室检测,确诊为蓝耳病与圆环病毒混合感染.
通过流行病学调查、临床症状,病理剖检,结合对可能发生的疫病的实验室检测,初步确诊这个猪场发生疫病流行是由猪瘟病毒和猪附红细胞体病混合感染造成的.通过采取一系列综合防治措施,猪场疫情得到有效控制.
本试验将27只六周龄SPF昆明小鼠随机分为三组:阴性对照组12只、一次性攻毒组12只、连续攻毒组3只.阴性对照组和连续攻毒组于第0天分别接种1640培养液1ml和PCV2细胞培养毒1ml(TCID50=107/ml),连续攻毒组应用相同的接种剂量和接种方式于第0、7、14、28、35天进行PCV2接种.阴性对照组和一次性攻毒组分别在接种后7、14、28和42天处死,连续攻毒组在首次接种后42天处死
本研究在实验室前期研究的基础上,选取4个有效抑制猪瘟病毒增殖的干扰基因N1、N2、S10和S11,其中N1和N2针对Npro基因,S10针对NS3基因,S11针对NS4A基因,进行逆转录病毒栽体介导的抑制猪瘟病毒增殖的研究.首先包装出重组逆转录病毒,感染PK-15细胞获得稳定表达干扰基因的细胞克隆,然后采用间接免疫荧光、荧光定量PCR和病毒滴度三种方法测定了细胞表达的shRNA抑制猪瘟病毒增殖水平
利用抗猪瘟病毒高免血清和猪瘟病毒特异的单克隆抗体充当免疫压力,体外构建猪瘟病毒在免疫压力下的进行传代的细胞模型,进行了免疫压力下猪瘟病毒遗传变异研究.结果表明:在免疫压力下,猪瘟病毒在细胞水平进行传代后,未表现出逃逸抗体中和作用的表型.该研究为我国现行的猪瘟防疫政策的制定奠定了理论基础,为进一步研究猪瘟病毒遗传变异机制奠定抗基础.
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