EMP途径是一切生物有机体中普遍存在的葡萄糖降解的途径,而代谢途径中的限速酶往往决定反应的速度,所以限速酶的研究对于途径高速公路的构建具有重要的作用.传统研究关键酶的方法是通过基因工程改造在目标酶基因前插入调节性的启动子,来调节酶的表达量进而研究酶对途径通量的影响,但是这种方法费时费力,而且不能同时对多个酶进行研究,并且胞内反应由于受到细胞膜以及胞内基因调控的影响不利于代谢途径的快速研究,而胞外反应由于不受这些因素的影响,并且具有反应速率快,容易控制等特点,是一个研究代谢途径的有效方法.本文主要通过体外多酶反应确定已有菌株的关键酶,再通过体内改造菌株以达到糖酵解途径高效生成目标产物乳酸.在确定途径关键酶的过程中通过在粗酶中添加不同浓度纯酶来提高反应速率的方法来确定粗酶中含有的纯酶含量,根据已有的含量,从初始底物出发,分别添加相同倍数的粗酶中相应纯酶量,通过测定产物变化计算获得通量控制系数(FCCs)确定关键酶,并进行体外连续反应初步验证关键酶效果.本文利用纯酶滴定的方法确定粗酶中含有1.09μM Glk,1.74μM Pgi,2.26μM PfkA,6.7μM FbaA,3.6μM TpiA,41μM GapA,19.6μM Pgk,132nM PykA,初始底物为5mM Glu,5mM ATP,2mM NAD+,2mM ADP,2mM Pi添加等量粗酶,在这个基础上添加相应粗酶含量的2倍纯酶,通过HPLC来测定乳酸,计算途径中不同酶改变后通量控制系数(FCCs)的变化,FCCs越大代表酶浓度改变后对途径的通量影响越大.得出的结果是：PykA改变后,FCCs的变化最大,其次是GapA,推测该菌株PykA是限速酶,GapA可能是限速酶.