【摘 要】
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目的 探讨人乳头状瘤病毒(HPV) 16 E6E7基因与三种N-亚硝基化合物对BALB/c 3T3细胞恶性转化的协同作用.方法 从含H PV16全基因组序列的质粒上扩增HPV16 E6E7基因,与质粒载体pcDNA 3.1(+)相连构建重组质粒,使用FuGENE HD试剂将重组质粒转染BALB/c 3T3细胞,使用G418筛选获得阳性细胞克隆Balb-E6E7,采用RT-PCR和Western b
【机 构】
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北京联合大学生物化学工程学院,北京100023
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目的 探讨人乳头状瘤病毒(HPV) 16 E6E7基因与三种N-亚硝基化合物对BALB/c 3T3细胞恶性转化的协同作用.方法 从含H PV16全基因组序列的质粒上扩增HPV16 E6E7基因,与质粒载体pcDNA 3.1(+)相连构建重组质粒,使用FuGENE HD试剂将重组质粒转染BALB/c 3T3细胞,使用G418筛选获得阳性细胞克隆Balb-E6E7,采用RT-PCR和Western blot技术检测Balb-E6E7细胞中HPV16E6E7基因和蛋白表达；应用细胞转化实验研究三种N-亚硝基化合物-司莫司汀、N-亚硝基二甲胺、N-甲基-N亚硝脲诱导Balb-E6E7细胞和BALB/c 3T3细胞的恶性转化,并检验转化细胞在软琼脂上形成集落的能力及对SCID鼠的致瘤能力.结果 RT-PCR和Western blot检测结果表明HPV16 E6E7基因与蛋白均可在阳性克隆Balb-E6E7细胞中有效表达.Balb-E6E7细胞和BALB/c 3T3细胞在司莫司汀、N-亚硝基二甲胺、N-甲基-N亚硝脲的诱导下均会发生细胞转化,转化细胞表现出嗜碱深染、致密多层、丧失接触抑制、排列紊乱、转化灶边缘的细胞自由定向生长、向周围单层细胞侵袭生长等明显恶性特征.在相同N-亚硝基化合物的诱导下,Balb-E6E7细胞比BALB/c 3T3细胞形成的转化灶个数增加3～21倍,且形成转化灶的时间明显缩短,可缩短25％.将正常与转化细胞接种至软琼脂中比较其形成克隆的能力,以形成克隆个数多少、生长快慢和直径大小排序,其顺序依次为：阳性对照HeLa细胞、Balb-E6E7转化细胞、BALB/c 3T3转化细胞,其克隆形成率分别为：60.1％,25.7％和5.2％.再分别将正常细胞、Balb-E6E7转化细胞与BALB/c3T3转化细胞接种1×107个至SCID鼠前肢皮下,每组3只,定期观察小鼠.正常BALB/c 3T3细胞未能在小鼠体内形成肿瘤,接种两种转化细胞的小鼠最终均可形成肿瘤,成瘤率为100％,4周时接种BalbE6E7转化细胞与BALB/c 3T3转化细胞的小鼠肿瘤直径分别为1.6±0.5和(1.1±0.3) cm.结论 HPV16 E6E7基因与N-亚硝基化合物对诱导BALB/c 3T3细胞的恶性转化具有协同作用,它们可诱导更多细胞发生转化,增强细胞恶性程度,加速细胞癌变进程,从而为HPV、环境化学因素与肿瘤病因学的关系提供证据,对环境化学物、病毒等危险因子的评估和肿瘤预防具有一定意义.
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