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背景:NLRP3(The NOD-,LRR-and pyrin domain-containing protein 3)炎症小体促进IL-1β的成熟与分泌,在介导先天性免疫反应中起重要作用。它的异常活化与多种发病进展密切相关,如非酒精性脂肪肝、败血症、痛风、阿尔茨海默病、糖尿病、动脉粥样硬化等,抑制NLRP3炎症小体有利于改善这些疾病的进程。作为新兴领域,针对NLRP3炎症小体的药物尚处于临床研究中,有望成为新一代的重磅新药。老药新用是开发新药最有效的策略之一,通过对老药化合物库的筛选,发现戒酒药双硫仑(Disulfiram,DSF)能够有效抑制NLRP3炎症小体活化。双硫仑作为戒酒药已有50多年的历史,被证明相对安全,具有良好药代动力学性质,且大多数患者都能很好地耐受。此外,已有文献报道双硫仑在一些炎症性疾病相关的动物模型中具有良好的保护作用,但其机制均不明确。在本论文中,将对双硫仑抗NLRP3炎症小体的药理作用、生物学机制以及在相关动物模型中的药效进行深入的探讨。目的:探讨双硫仑抑制NLRP3炎症小体活化的机制,明确其在相关炎症动物模型中的药效。方法:第一部分:(1)采用CCK8检测双硫仑对J774A.1细胞是否有毒性;(2)采用ELISA检测双硫仑对LPS/Nigericin或LPS/ATP诱导IL-1β分泌的影响;采用WesternBlot检测双硫仑对IL-1β和P20释放以及NLRP3、ASC、Pro-IL-1β、Pro-Caspase-1蛋白表达的影响;采用LDH检测双硫仑对细胞焦亡的影响;(3)采用其他细胞验证双硫仑对NLRP3炎症小体的影响;(4)采用ELISA检测ALDH抑制剂对NLRP3炎症小体活化的影响。第二部分:(1)-(3)采用Lysotracker探针、AO探针、Real-time PCR、Western Blot检测双硫仑对溶酶体膜稳定性以及Cathepsin B变化的影响。第三部分:(1)采用DCFH-DA和MitoSOX分别检测ROS和线粒体ROS生成;采用NADPH氧化酶抑制剂DPI探讨NADPH氧化酶来源的ROS对NLRP3炎症小体活化调控;(2)采用MQAE检测双硫仑对NLRP3炎症小体活化过程中氯离子外流的影响。第四部分:(1)LPS诱导腹膜炎小鼠模型,灌胃给药双硫仑,采用ELISA检测血清和腹腔液内炎症因子和肝内Caspase-1活性;(2)MSU诱导痛风性关节炎动物模型,灌胃给药双硫仑,采用ELISA检测血清IL-1β含量和关节组织Caspase-1活性;采用H&E染色关节滑膜组织,观察炎症细胞浸润和滑膜结构变化。第五部分:(1)采用ELISA检测双硫仑这一类化合物对NLRP3炎症小体的影响;采用CCK8检测双硫仑类似物对J774A.1细胞毒性影响;(2)采用Western Blot检测双硫仑类似物对IL-1β和P20释放以及NLRP3、ASC、Pro-IL-1β、Pro-Caspase-1蛋白表达的影响;LPS诱导腹膜炎小鼠模型,灌胃给药双硫仑类似物4和6t,ELISA检测血清和腹腔液内IL-1β和肝内Caspase-1活性。结果:第一部分:(1)双硫仑(2、5、10μM)孵育2 h或24 h对J774A.1细胞无明显细胞毒性;(2)双硫仑抑制Caspase-1活化与IL-1β的释放(P<0.05),但不影响NLRP3、ASC、Pro-IL-1β、Pro-Caspase-1蛋白的表达;双硫仑抑制细胞焦亡;(3)双硫仑抑制THP-1细胞和混合胶质细胞内NLRP3炎性小体的活化(P<0.05);(4)ALDH抑制剂不影响IL-1β的分泌。第二部分:(1)双硫仑改善溶酶体受损情况;(2)双硫仑没有影响J774A.1细胞溶酶体基因(LAMP1、LAMP2、Cathepsin B、Cathepsin D),但双硫仑在基因和蛋白水平上均降低TFEB的上调(P<0.05);(3)双硫仑改善溶酶体膜破裂,且改善溶酶体内LPS/Nigericin诱导组织蛋白酶B降低(P<0.01)。第三部分:(1)双硫仑降低LPS和LPS/Nigericin诱导细胞总ROS的升高(P<0.05),但不影响线粒体ROS生成;双硫仑抑制ROS的能力弱于DPI,但抑制IL-1β的效力强于DPI(P<0.05);(2)双硫仑不影响NLRP3炎症小体活化过程中氯离子外流。第四部分:(1)双硫仑减少腹腔炎模型中血清和腹腔液中IL-1β含量(P<0.01),降低肝脏中Caspase-1活性(P<0.05)。双硫仑下调腹腔液中IL-6和TNF-α含量(P<0.05);(2)双硫仑降低痛风性关节炎模型血清中IL-1β表达(P<0.05)和关节组织内Caspase-1含量(P<0.05);双硫仑改善关节炎症反应和滑膜增生的情况。第五部分:(1)双硫仑类似物具有与双硫仑相似抗IL-1β活性;DSF类似物对J774A.1细胞无明显毒性;(2)双硫仑类似物4和6t抑制P20与IL-1β的释放,但不影响NLRP3、ASC、Pro-IL-1β、Pro-Caspase-1蛋白的表达;双硫仑类似物化合物4和6t均能减轻腹膜炎模型中血清和腹腔液IL-1β分泌(P<0.01)和肝脏Caspase-1的活性(P<0.05)。结论:在这项研究中,首次发现戒酒药双硫仑能够有效抑制NLRP3炎症小体活化,并抑制细胞焦亡。双硫仑阻止溶酶体内组织蛋白酶B释放到细胞质中,从而抑制溶酶体外的组织蛋白酶B对NLRP3炎症小体的活化。双硫仑也减少了总ROS的生成,但线粒体来源的ROS未有变化,双硫仑对NLRP3炎症小体的抑制可能部分依赖于对ROS的抑制。更重要的是,双硫仑对LPS诱导的腹膜炎和MSU诱发的痛风性炎症模型均有显著的改善作用。