流行性感冒(Influenza，简称流感)是由流行性感冒病毒(Influenza virus，简称流感病毒)引起的急性呼吸道病，潜伏期短、发病率高、传染性强、传播快，对人类健康威胁极大。流感病毒核酸为分节段单链负股RNA，通常分8个片段。根据NP和M抗原的不同，流感病毒分甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，又可根据HA和NA抗原的差别分为不同亚型。甲型流感病毒(InfluenzaAvirus，IAV)有17个HA亚型和10个NA亚型。流感病毒基因组中突变率最高的是HA基因，其次是NA基因。其变异机理涉及分子水平的抗原漂移(antigenic drift)和抗原转换(antigenic shift)。　　由于流感病毒易变异，且流感至今尚无特效治疗方法，因此流感的预防显得尤为重要。接种疫苗是预防流感最有效的手段。现有疫苗都是株特异性的，通过体液免疫产生的中和抗体对抗病毒感染，疫苗所含的抗原必须和流行株抗原有较高的相似性才能起到保护作用。异型流感病毒感染时，疫苗的保护作用受到限制。因此，“普遍的”、“通用型”疫苗成为科学家关注的焦点。近几十年来，众多学者利用各种甲型流感病毒共有抗原成分，如NP或M，制备疫苗免疫小鼠，发现可以在异型流感病毒间发生部分交叉免疫。另外，流感病毒疫苗和佐剂连接疫苗亦存在部分异型株间交叉免疫保护作用。研究表明，流感病毒特异性抗体，往往由流感病毒表面蛋白HA抗原刺激产生，特异性强，不能中和异型流感病毒;而上述流感病毒共有抗原产生的抗体，抗体滴度低或为非中和抗体，达不到阻止异型流感病毒感染的目的。特异性细胞免疫应答反应在抗异型流感病毒感染中的作用，尚无统一结论，仍需进一步研究。　　为了解H5亚型和H1亚型间的交叉保护作用，我们选择了H5亚型流感疫苗免疫小鼠，H1亚型流感病毒感染小鼠，发现H5亚型和H1亚型间存在交叉保护作用，且异型流感病毒感染小鼠肺中IFN-γ水平明显增高。基于这一结果，在后续的实验中，以IFN-γ为中心，研究在异型流感病毒感染过程中与其相关的免疫分子及细胞的变化情况。IFN-γ既可以阻止病毒在体内的复制、扩散，又能对多种免疫细胞发挥强大的调节作用，在抗流感病毒感染的过程中同样发挥重要作用。那么与IFN-γ相关的其他细胞因子表达水平如何？它们在异型流感病毒感染中发挥作用如何？肺泡巨噬细胞(Pulmonary alveolar macrophage，PAM)作为重要的抗原提呈细胞(Antigen presenting cells，APC)，其表面分子的表达可能会影响流感病毒异型免疫（Heterosubtypic immunity，HSI）的能力。这些表面分子在流感病毒的HSI中表达水平升高还是降低？是增强免疫还是抑制免疫？这些问题有待于进一步深入研究。　　IFN-γ可以促使CD8+T细胞成熟为效应CTL细胞;活化巨噬细胞，提高其吞噬能力;激活NK细胞，增强其清除感染细胞的能力。T细胞是介导细胞免疫的主要细胞。在异型流感病毒感染的过程中，T细胞的增殖活性如何？执行细胞免疫功能的、有活性的T细胞水平如何？巨噬细胞和NK细胞是执行免疫应答的一种重要细胞，具有抗原加工、提呈和免疫调节等作用。巨噬细胞和NK细胞虽然是固有免疫中重要的免疫细胞，但它们也是连接固有免疫和获得性免疫的桥梁。在流感病毒的HSI中，巨噬细胞和NK细胞发挥怎样的作用？其杀伤能力如何？　　为回答上述问题，我们拟对小鼠进行H5亚型流感病毒免疫、H1流感病毒感染，特别采用免疫佐剂IL-2加强免疫，通过对比分析各组小鼠主要免疫分子水平及免疫细胞功能变化的特点，以期确定异型流感病毒交叉保护作用的主要效应机制，及与IFN-γ相关的免疫分子、免疫细胞的水平、活性，为流感的预防和有效控制提供新的理论依据。　　材料与方法：　　一、实验材料　　1、流感病毒A/H1N1;rL H5流感重组活疫苗、A/H5N1流感灭活疫苗;2、6-8周龄雌性C57BL/6小鼠;　　3、细胞因子检测试剂盒;　　4、RNA提取相关试剂，RT试剂盒，Real-time PCR相关试剂;　　5、MTT检测试剂盒;　　6、流式细胞术检测相关抗体及试剂;　　7、NO检测相关试剂等。　　二、实验方法　　1、C57BL/6小鼠(6-8周，雌性)随机分组:异型免疫组，异型免疫加强组，同型组，PBS对照组，IL-2对照组。分别用流感疫苗、A/H1N1病毒和PBS免疫小鼠两次，用A/H1N1流感病毒感染。在感染前(0d)和感染后4d、7d处死小鼠，收集肺泡灌洗液，肺、脾组织，血液等样品。　　2、记录小鼠肺重、体重和死亡情况，计算肺指数和生存率。　　3、ELISA方法测定肺中IL-2、IL-4、IL-10和IFN-γ的水平，流式细胞术测定CD4+T、CD8+T细胞水平。　　4、Real-time PCR方法测定肺内病毒量。　　5、血清中H1N1抗体水平测定。　　6、PAM表面MHCⅠ、MHCⅡ和TLR7测定。　　7、细胞因子IL-6、IL-12、IL-18、TNF-α的测定。　　8、T细胞增殖活性测定及IFN-γ+CD4+T和IFN-γ+ CD8+T细胞水平测定。　　9、巨噬细胞释放NO能力的测定。　　10、CD49b+ NKG2D+ NK细胞水平测定。　　11、使用SPSS17.0统计软件进行数据处理。各组数据以均数±标准差（mean±s）表示，采用单因素方差分析比较各组间的统计学差异;当有统计学意义时，用SNK法进行组间比较，p＜0.05具有统计学意义。　　结果：　　1、流感病毒异型免疫组和异型免疫加强组与PBS组相比，小鼠生存率升高、肺指数、肺病毒载量降低;异型免疫组和异型免疫加强组肺内的IL-10和IFN-γ的含量、脾中CD4+T和CD8+T细胞水平显著高于同型免疫组和感染前。除同型对照组外，其他各组未有H1N1抗体检出。　　2、流感病毒异型免疫组和异型免疫加强组小鼠PAM表面的MHCⅠ的表达水平显著高于感染前和同型免疫组，且异型免疫加强组高于异型免疫组。其他表面分子未见显著变化。异型免疫组和异型免疫加强组小鼠肺中细胞因子IL-6、IL-18和TNF-α的水平分别显著高于PBS组和单纯使用IL-2组。异型免疫组和异型免疫加强组小鼠肺中细胞因子IL-6、IL-18和TNF-α的水平显著高于同型免疫组。IL-12的含量未见显著变化。　　3、流感病毒异型免疫组和异型免疫加强组小鼠脾脏中T细胞的增殖活性显著高于PBS组和感染前。感染后7d异型免疫组和异型免疫加强组小鼠脾脏中IFN-γ+CD4+T和IFN-γ+ CD8+T细胞的含量显著高于感染前和同型免疫组。异型免疫加强组小鼠脾脏中IFN-γ+ CD4+T和IFN-γ+CD8+T细胞的含量显著高于单纯使用IL-2组。异型免疫组和异型免疫加强组小鼠脾脏中巨噬细胞释放的NO水平显著高于同型免疫组。异型免疫组和异型免疫加强组小鼠脾脏中巨噬细胞释放的NO水平分别显著高于PBS组和单纯使用IL-2组。异型免疫组和异型免疫加强组小鼠脾中CD49b+ NKG2D+ NK细胞水平显著高于同型免疫组和PBS组。　　结论：　　1、流感病毒H5亚型与H1亚型间存在交叉免疫保护作用。　　2、在流感病毒的HSI中，抗体的保护作用不大，细胞免疫保护作用明显。T细胞增殖能力显著增强，IFN-γ+CD4+T细胞和IFN-γ+CD8+T细胞含量显著增加。异型流感病毒感染后肺中IFN-γ水平升高，巨噬细胞分泌IFN-γ相关细胞因子IL-6、IL-18和TNF-α水平升高，共同发挥抗病毒感染的功能。巨噬细胞、NK细胞活性增强。　　3、PAM表面分子MHC-Ⅰ表达显著升高，在流感病毒HSI中发挥免疫调节作用。　　4、免疫佐剂IL-2可以加强流感病毒的异型免疫交叉保护作用。