【摘 要】
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HSP 27基因能通过调控颗粒细胞的凋亡间接影响卵泡发育和排卵过程,从而影响藏羊的繁殖性状。为了研究HSP 27基因在藏羊卵巢颗粒细胞凋亡中的作用,本试验首先检测HSP 27蛋白在藏羊卵巢组织中的表达定位;其次干扰和过表达HSP 27基因在颗粒细胞中的表达,分析HSP 27基因对藏羊卵巢颗粒细胞中相关基因表达和颗粒细胞凋亡的影响;最后检测HSP 27基因对颗粒细胞分泌雌二醇和孕酮的影响,并利用实时
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HSP 27基因能通过调控颗粒细胞的凋亡间接影响卵泡发育和排卵过程,从而影响藏羊的繁殖性状。为了研究HSP 27基因在藏羊卵巢颗粒细胞凋亡中的作用,本试验首先检测HSP 27蛋白在藏羊卵巢组织中的表达定位;其次干扰和过表达HSP 27基因在颗粒细胞中的表达,分析HSP 27基因对藏羊卵巢颗粒细胞中相关基因表达和颗粒细胞凋亡的影响;最后检测HSP 27基因对颗粒细胞分泌雌二醇和孕酮的影响,并利用实时荧光定量检测细胞凋亡和激素分泌的相关基因的相对表达量。结果表明:（1）通过对藏羊卵巢组织进行免疫组化,发现在藏羊卵巢组织中,HSP 27蛋白主要在生殖上皮和大小不一的卵泡的颗粒细胞层中表达。（2）构建藏羊HSP 27过表达和干扰载体,转染至颗粒细胞中进行表达,结果表明,HSP 27过表达组的HSP 27基因表达量极显著高于对照组（NC空载组）（P＜0.01）,干扰组（HSP 27-sh RNA2组）的HSP 27基因表达量极显著低于对照组（NC空载组）（P＜0.01）。说明成功构建HSP 27过表达载体和干扰载体,并在藏羊颗粒细胞中成功表达。（3）与对照组（NC空载组）相比,过表达HSP 27基因能极显著抑制藏羊卵巢颗粒细胞的凋亡率（P＜0.01）,干扰HSP 27基因能显著促进颗粒细胞的凋亡（P＜0.05）;与对照组（NC空载组）相比,过表达HSP 27基因能极显著下调Bax基因的表达量（P＜0.01）,干扰HSP 27基因（HSP 27-sh RNA组）有下调Bcl-2基因表达量的趋势（P=0.053）。结果说明HSP 27基因通过抑制Bax基因的表达来发挥抗凋亡作用。（4）与对照组（NC空载组）相比,表明过表达HSP 27基因能促进颗粒细胞的雌二醇（P＜0.05）和孕酮（P＜0.01）的分泌水平,并促进Erβ（P＜0.01）、3β-HSD（P＜0.01）和CYP19A1（P＜0.05）的m RNA表达量,干扰HSP 27基因的表达有抑制颗粒细胞E2分泌水平的趋势（P=0.052）,并且极显著抑制Erβ基因的相对表达量（P＜0.01）。结果说明过表达颗粒细胞中的HSP 27基因能通过促进Erβ、3β-HSD和CYP19A1基因的表达来提高藏羊卵巢颗粒细胞雌二醇和孕酮的分泌水平。（5）过表达和干扰颗粒细胞中的HSP 27基因时,转录组测序结果显示过表达HSP 27基因能抑制颗粒细胞中促细胞凋亡的相关基因表达量,干扰HSP 27基因能下调氧化磷酸化通路的ND2和COX1基因表达,进而影响细胞凋亡。根据测序结果筛选出EFNA2、IL2RA、LAMB1、APOA1、CTNND2、ADRB1、NOG、ADCY4、SLC6A12、GABRB3和RXRA 11个与卵泡发育相关的差异基因。综上所述,在本试验条件下,过表达HSP 27基因能抑制藏羊卵巢颗粒细胞的凋亡,并促进颗粒细胞对雌二醇和孕酮的分泌;干扰HSP 27基因能促进颗粒细胞的凋亡,并有抑制颗粒细胞E2分泌水平的趋势。
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