【摘 要】
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离子型γ-氨基丁酸（ionotropicγ-aminobuyric acid,i GABA）受体参与昆虫的多种生理活动,包括抗药性、睡眠、嗅觉记忆、运动和病毒免疫等。昆虫i GABA受体为五聚体受体,一般由RDL、GRD和LCCH3三种亚基组成。RDL亚基一直以来都是昆虫抗药性研究的热点,GRD和LCCH3两种亚基近年来虽逐渐引起人们的关注,但关于埃及伊蚊GRD亚基（Ae-GRD）的相关报道较少,
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离子型γ-氨基丁酸（ionotropicγ-aminobuyric acid,i GABA）受体参与昆虫的多种生理活动,包括抗药性、睡眠、嗅觉记忆、运动和病毒免疫等。昆虫i GABA受体为五聚体受体,一般由RDL、GRD和LCCH3三种亚基组成。RDL亚基一直以来都是昆虫抗药性研究的热点,GRD和LCCH3两种亚基近年来虽逐渐引起人们的关注,但关于埃及伊蚊GRD亚基（Ae-GRD）的相关报道较少,NCBI数据库中未见序列注释。伊维菌素和氟雷拉纳两种杀虫剂分别属于大环内酯类和异噁唑啉类,主要通过作用于i GABA受体和谷氨酸门控离子通道来干扰昆虫神经系统的正常生理功能,是有害昆虫防控的有效手段。这两种杀虫剂对埃及伊蚊有着高效的防治效果,但二者杀灭埃及伊蚊的具体分子机制尚未见报道。本研究首先利用生物信息学方法分析比较节肢动物的GRD亚基核苷酸保守区序列,设计Ae-GRD简并引物,并对其进行扩增,通过NCBI数据库搜索得到Ae-GRD核苷酸全长序列;构建GABA基因家族系统进化树,进行了GRD亚基核苷酸序列同源比较,从而对Ae-GRD的序列特征进行分析;利用荧光定量PCR方法构建RDL和GRD两个亚基在埃及伊蚊的时空表达谱,分析二者的表达特征;CRISPR-Cas9技术敲除Ae-RDL,分析突变株表型,进一步探索RDL亚基的功能;此外,还利用RNA干扰技术降低RDL亚基的表达,通过生物学测定探讨干扰虫株对伊维菌素及氟雷拉纳的敏感性,同时还使用双电极电压钳技术分析非洲爪蟾细胞卵母细胞中表达的RDL亚基,对不同浓度的伊维菌素及氟雷拉纳的反应,探究Ae-RDL与伊维菌素及氟雷拉纳之间的靶标关系。利用简并引物扩增,得到埃及伊蚊GRD的部分序列,在NCBI数据库中搜索得到两个转录本,系统进化树及氨基酸序列同源性比较分析结果表明,Ae-GRD在昆虫中同源性较高,说明该基因在昆虫中进化保守。时空表达谱结果表明在埃及伊蚊发育每个时期Ae-GRD、Ae-RDL均有表达,其中Ae-RDL在成蚊期表达量最高,而Ae-GRD在卵期及成蚊期表达量更为显著;在埃及伊蚊雌性成蚊体内,Ae-GRD、Ae-RDL都有类似的空间表达谱,即在头部以及附肢都有十分高的表达水平。CRISPR-Cas9技术将Ae-RDL敲除后,G0代死亡率较高,在很大程度上影响了蚊虫的正常生长,由于该突变株无法正常传代进行下一步实验。本研究采用饲喂法以及注射法分别对成蚊和幼虫进行RNA干扰,发现成蚊和幼虫体内Ae-RDL的表达水平都降低了近60%;进而对干扰虫株进行生物学测定,发现经伊维菌素和氟雷拉纳处理后的蚊虫,Ae-RDL干扰组的死亡率显著低于对照组。同时,本研究将Ae-RDL克隆到非洲爪蟾卵母细胞中进行受体表达后,经双电极电压钳技术对表达出的受体蛋白进行了功能鉴定。GABA诱导Ae-RDL同源五聚GABA受体产生内向电流的EC5 0值为121.5+/-84.27μM（n=3～6）;电生理结果表明,伊维菌素和氟雷拉纳对Ae-RDL均有明显的拮抗作用;除拮抗作用外,伊维菌素还对该受体有较强的增强作用和较弱的激活作用,而氟雷拉纳则无类似的效果。以上研究结果揭示了Ae-RDL和Ae-GRD在蚊虫体内的表达模式,Ae-RDL是伊维菌素和氟雷拉纳的靶点,这将为下一步杀虫机理的研究提供了新的思路。
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