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H7N9亚型禽流感病毒（Avian influenza virus,AIV）于2013年首次在中国东部长三角地区出现,至今共导致五波人感染事件。其中,第五波流行造成的感染人数最多,并且出现了高致病性变异病毒,对养殖业也造成了巨大损失。根据联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization,FAO）的数据显示,目前已有1568例实验室确诊的人感染H7N9亚型AIV的病例,616例死亡,死亡率高达40%,对公共卫生构成了重大威胁。H7N9亚型AIV已被证明具有引起流感大流行的潜力,因此研制高效的抗病毒制剂对于防控H7N9亚型禽流感的大流行具有重要意义。此外,由于疫苗的免疫压力以及流感病毒频繁的基因重配,H7N9亚型AIV在基因水平与抗原性上已发生了显著变异,且病毒已经很好地适应了鸭子这一流感病毒的“天然储库”,为病毒继续变异提供了条件。因此,研究病毒的抗原表位特征对于H7N9亚型禽流感疫苗与抗病毒制剂的研制及优化具有重要的参考意义。近年来,单克隆抗体（简称单抗）（Monoclonal antibody,mAb）制剂已成为人重大病毒性传染病防治的重要手段,也是进行病毒抗原性研究的有力工具。因此,本研究对H7N9亚型AIV血凝素（Hemagglutinin,HA）特异性单抗的生物学活性及其在小鼠模型中对H7N9病毒感染的保护效力进行评价,鉴定了单抗识别的抗原表位,并选择其中1株广谱反应性单抗建立了重组抗体表达的方法。本研究筛选了 1株对H7N9亚型AIV具有较强中和活性的单抗,在小鼠模型中对H7N9病毒的致死性感染具有较高的保护效力;鉴定了 HA蛋白中3个新的抗原表位,其中识别HA茎部保守表位的单抗对group 1和group 2的不同亚型流感病毒具有很广的交叉反应谱;测定了该广谱反应性抗体的可变区基因序列,建立了亚类转换重组抗体的表达方法,实现了单抗亚类由IgG1至IgG2a的转换,为后续抗体保护效力的优化奠定了基础。研究结果为H7N9亚型AIV的抗病毒治疗提供了候选单抗,为深入理解H7N9 HA蛋白的抗原表位特征提供了新的信息。1.H7N9亚型禽流感病毒HA单克隆抗体的生物学活性鉴定前期研究制备了 4 株针对 H7N9 病毒（A/chicken/Guangdong/GD15/2016,GD15）HA蛋白的单抗（1A1 1D7、1B10 1D1、4B7 4D5、5D3 1B5）,为了系统评估它们的生物学活性,测定了抗体对GD15株的血凝抑制（Hemagglutination inhibition,HI）活性、病毒中和活性（Virus neutralization,VN）以及与HA蛋白的结合特性。结果显示,4株单抗与HA蛋白的反应性均较强,能够有效识别杆状病毒系统表达的重组HA蛋白以及H7N9病毒感染MDCK细胞中表达的HA蛋白。其中,4B7 4D5对H7N9病毒具有较强的HI与VN活性,HI效价为8 log2,VN效价为1:5120。4B7 4D5仅与H7亚型AIV反应,具有较强的亚型特异性。另外3株单抗既没有HI活性,也没有VN活性,但对不同亚型流感病毒具有交叉反应性:1A1 1D7、1B10 1D1与H7、H15亚型反应,而5D3 1B5则与group 1和group 2中不同亚型的流感病毒具有广谱反应性。因此,对H7N9亚型AIV HA蛋白特异性单抗的生物学活性及交叉反应性进行了系统分析,为后续抗体的表位筛选与体内效力评价奠定了基础。2.H7N9亚型禽流感病毒HA单克隆抗体的保护效力评价本研究基于BALB/c小鼠模型,采用被动免疫的方式评估4株单抗针对H7N9病毒感染的保护效力。选用1株经小鼠体内连续传11代的H7N9鼠适应株（JTC4 M11）为攻毒株。首先,进行预防性保护试验评价抗体保护性,结果表明,未免疫小鼠于JTC4 M11感染后短时间内出现体重迅速下降,表现严重的临床症状,于攻毒后14天内全部死亡;1A1 1D7和5D3 1B5的各剂量均不能提供保护,而1B10 1D1（10、20、30 mg/kg）和4B7 4D5（5、10、20、30mg/kg）均能够对H7N9病毒感染提供100%的保护率。虽然1B10 1D1处理的小鼠在H7N9病毒感染后不死亡,但是肺脏与鼻甲骨的病毒分离率较高,肺脏表现明显的炎性损伤;而4B7 4D5处理组的病毒分离率显著低于对照和1B101D1处理组,肺脏病理损伤轻微,具有良好的保护作用。接着评价4B7 4D5对H7N9病毒感染小鼠的治疗保护性效果,结果显示,高剂量的4B7 4D5（30 mg/kg）在感染后12 h可提供对H7N9病毒攻击100%的保护;但是在感染后24h施用抗体,相同剂量的单抗仅能提供40%的保护率。以上结果说明,4B7 4D5在预防性与早期（12 h）治疗性保护试验中能够提供针对H7N9病毒感染的高效保护,具有较好的应用潜力。3.H7N9亚型禽流感病毒HA单克隆抗体的抗原表位鉴定解析HA蛋白的抗原表位特征是了解H7N9亚型AIV抗原变异的关键,也是研制疫苗与抗病毒单抗制剂的重要基础。本研究以3株单抗（1B10 1D1、4B7 4D5、5D3 1B5）作为研究对象,采用基于多肽的ELISA、噬菌体表面展示随机多肽文库筛选以及免疫逃逸筛选的方法鉴定了 HA蛋白中3个新的抗原表位,并用生物信息学方法分析了表位的保守性与空间定位。用免疫逃逸方法鉴定中和单抗4B7 4D5识别的抗原表位,发现筛选的免疫逃逸株与4B7 4D5的HI滴度相较母本病毒（GD15）下降8倍,HA基因含有G151R/E与I335V突变。用定点突变方法向HA蛋白引入G151E与I335V的突变,仅含有G151E突变的重组H7N9病毒与4B7 4D5的HI及VN反应性显著降低,说明4B7 4D5识别表位的关键氨基酸为HA蛋白G151位点。此外,用基于多肽的ELISA与噬菌体表面展示随机多肽文库筛选,鉴定5D3 1B5识别的表位是位于HA茎部的431W-433Y-437L基序,1B10 1D1则识别位于HA头部的220Q-225S-227G基序。将鉴定的抗原表位进行突变均显著降低H7N9病毒与对应单抗的反应性。抗原保守性与定位分析表明,4B7 4D5识别的G151位点位于HA头部抗原位点A（Antigenic site A）中,在H7亚型AIV中高度保守;1B10 1D1识别的表位位于HA头部受体结合位点附近220-loop中,在不同亚型流感病毒之间变异性较大;而5D3 1B5针对的表位位于HA茎部C-螺旋区,在不同亚型病毒之间高度保守。因此,本研究鉴定了 HA蛋白中3个新的抗原表位,其中2个位于头部,1个位于茎部,为认识H7N9亚型AIV HA蛋白的抗原表位特征提供了新的信息。4.5D3 1B5亚类转换嵌合抗体表达的初步研究5D3 1B5对group 1和group 2不同亚型流感病毒具有很广的交叉反应谱,但是该抗体为IgG1亚类,且不具有VN活性,对H7N9病毒感染没有保护效力。研究表明,非中和抗体能够通过可结晶片段（Fragment crystalizable,Fc）依赖的免疫效应提供保护,而抗体与免疫效应细胞表面Fc受体（Fc receptor,FcR）的亲和力是其保护力的重要决定因素。鼠源IgG2a亚类与FcR的亲和力最高,而IgG1亚类与FcR的亲和力最低。因此,本研究拟将5D3 1B5的亚类转换为IgG2a,旨在提升抗体的保护效力。首先,测定了 5D3 1B5重链可变区（Variable region of the heavy chain,VH）与轻链可变区（Variable region of the light chain,VL）的编码基因序列,定位了可变区中互补决定区（Complementarity-determining region,CDR）并分析了其与HA蛋白的分子对接特性。其次,将VH与VL基因克隆至已含有鼠源IgG2a恒定区的表达载体中,构建了嵌合抗体的表达载体。质粒共转染至中国仓鼠卵巢细胞（CHO）,用ELISA、IFA与免疫印迹鉴定了抗体的表达,且抗体亚类由IgG1转变为IgG2a,嵌合抗体与H7N9 HA蛋白的反应性与母本抗体（5D3 1B5）相同。本研究建立了鼠源重组抗体的表达方法,实现了抗体亚类由IgG1向IgG2a的转换,为后续抗体效力的优化提供了技术支持。