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从海洋红藻中提取的琼胶广泛应用于食品及其他领域,但复杂的多糖结构限制了其消化利用价值。琼胶寡糖(Agar oligosaccharide,AOS)是由琼胶多糖水解得到的聚合度为2~10低分子量糖类,具有抗氧化,抗肿瘤,抗病毒和免疫调节等多种生物学活性。本研究利用模式生物黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)为对象,探讨AOS的抗衰老功效及相关作用机制,并以J774A1和RAW264.7细胞为模型进一步验证AOS的体外抗炎活性。具体内容如下:
(1)在黑腹果蝇的标准培养基中分别加入高(0.25%)、中(0.125%)、低(0.0625%)三个剂量的AOS,对AOS的抗衰老表观现象包括寿命、攀爬能力、繁殖能力进行评估。结果表明,在一定浓度范围内,AOS可以有效延长雄性果蝇的平均寿命及最大寿命,提高运动活力,降低繁殖能力。对雌性果蝇的影响不显著。
(2)对AOS抗衰老功效相关机制的初步探讨。
1)分别取三个剂量组中的10日龄、25日龄、40日龄的果蝇全组织进行铜锌-超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活力检测及丙二醛(MDA)的含量检测。结果表明,在一定浓度范围内,AOS可以显著提高雄性果蝇全组织Cu,Zn-SOD、CAT的活力,降低MDA的含量。对雌性果蝇的抗氧化能力无显著影响。
2)利用16S rDNA高通量测序法分析中剂量组10日龄、40日龄各组果蝇中肠肠道微生物组成。结果显示AOS显著降低了40日龄雄蝇肠道微生物的α-多样性及门水平中变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)的丰度,同时增加了属水平中葡糖杆菌(Gluconobacter)的丰度。对于老年雌果蝇,AOS显著提高了其α-多样性,降低了其葡糖杆菌的丰度。
3)利用荧光定量PCR(Real Time PCR,RT-PCR)对四个肠道免疫相关基因:Drosocin(DRO)、DUOX、IMD、PIMS的表达进行定量分析。与对照组相比,雄性老年果蝇实验组中DRO及DUOX在各组中表达无显著性差异,而PIMS的表达显著性降低,IMD的表达显著性提高。雌性老年果蝇实验组中DRO的表达显著降低,DUOX的表达显著提高,PIMS和IMD的表达显著降低。
(3)AOS对SDS诱导的雄果蝇肠道炎症损伤的保护及免疫调节作用。
1)利用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)诱导雄果蝇的肠道炎症损伤,并检测各组果蝇的生存率和致炎60h后的果蝇中肠上皮细胞在透射电镜下的超微结构。结果表明,AOS可以有效延长各组果蝇的生存率,缓解SDS对果蝇中肠上皮细胞损伤。
2)利用16S rDNA高通量测序分析致炎60h的果蝇肠道微生物组成。结果显示,AOS增加了SDS致炎果蝇的肠道微生物的α-多样性,降低了产气克雷伯氏菌的丰度。
3)利用qPCR检测致炎60h的果蝇肠道免疫相关基因的表达。结果表明,AOS激活了AttacinA(AttA)、CecropinC(CecC)、Defensin(Dfn)、Diptercin(Dpt)及4E-BP基因的表达;下调了Relish,Dredd、FADD及mTOR的表达;并且抑制了自噬相关基因AMPKα、Atg1、Atg5、Atg8a的表达。
(4)AOS体外抗炎活性的研究
选择小鼠单核巨噬细胞(J774A1)和小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)进行脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)致炎,研究AOS对炎症细胞抗炎能力的影响。结果表明,AOS可以显著降低NO的产生和释放;抑制白介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子(TNF-α)在蛋白质水平表达和分泌。
(1)在黑腹果蝇的标准培养基中分别加入高(0.25%)、中(0.125%)、低(0.0625%)三个剂量的AOS,对AOS的抗衰老表观现象包括寿命、攀爬能力、繁殖能力进行评估。结果表明,在一定浓度范围内,AOS可以有效延长雄性果蝇的平均寿命及最大寿命,提高运动活力,降低繁殖能力。对雌性果蝇的影响不显著。
(2)对AOS抗衰老功效相关机制的初步探讨。
1)分别取三个剂量组中的10日龄、25日龄、40日龄的果蝇全组织进行铜锌-超氧化物歧化酶(Cu,Zn-SOD)、过氧化氢酶(CAT)的活力检测及丙二醛(MDA)的含量检测。结果表明,在一定浓度范围内,AOS可以显著提高雄性果蝇全组织Cu,Zn-SOD、CAT的活力,降低MDA的含量。对雌性果蝇的抗氧化能力无显著影响。
2)利用16S rDNA高通量测序法分析中剂量组10日龄、40日龄各组果蝇中肠肠道微生物组成。结果显示AOS显著降低了40日龄雄蝇肠道微生物的α-多样性及门水平中变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)的丰度,同时增加了属水平中葡糖杆菌(Gluconobacter)的丰度。对于老年雌果蝇,AOS显著提高了其α-多样性,降低了其葡糖杆菌的丰度。
3)利用荧光定量PCR(Real Time PCR,RT-PCR)对四个肠道免疫相关基因:Drosocin(DRO)、DUOX、IMD、PIMS的表达进行定量分析。与对照组相比,雄性老年果蝇实验组中DRO及DUOX在各组中表达无显著性差异,而PIMS的表达显著性降低,IMD的表达显著性提高。雌性老年果蝇实验组中DRO的表达显著降低,DUOX的表达显著提高,PIMS和IMD的表达显著降低。
(3)AOS对SDS诱导的雄果蝇肠道炎症损伤的保护及免疫调节作用。
1)利用十二烷基硫酸钠(Sodium dodecyl sulfate,SDS)诱导雄果蝇的肠道炎症损伤,并检测各组果蝇的生存率和致炎60h后的果蝇中肠上皮细胞在透射电镜下的超微结构。结果表明,AOS可以有效延长各组果蝇的生存率,缓解SDS对果蝇中肠上皮细胞损伤。
2)利用16S rDNA高通量测序分析致炎60h的果蝇肠道微生物组成。结果显示,AOS增加了SDS致炎果蝇的肠道微生物的α-多样性,降低了产气克雷伯氏菌的丰度。
3)利用qPCR检测致炎60h的果蝇肠道免疫相关基因的表达。结果表明,AOS激活了AttacinA(AttA)、CecropinC(CecC)、Defensin(Dfn)、Diptercin(Dpt)及4E-BP基因的表达;下调了Relish,Dredd、FADD及mTOR的表达;并且抑制了自噬相关基因AMPKα、Atg1、Atg5、Atg8a的表达。
(4)AOS体外抗炎活性的研究
选择小鼠单核巨噬细胞(J774A1)和小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(RAW264.7)进行脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)致炎,研究AOS对炎症细胞抗炎能力的影响。结果表明,AOS可以显著降低NO的产生和释放;抑制白介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子(TNF-α)在蛋白质水平表达和分泌。