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食品是人类赖以生存和发展的物质基础，食品安全是关乎人民健康与国计民生的重大课题。目前，各种食品安全问题层出不穷，尤其是食源性病原体的污染，对人们健康造成极大的危害。在世界范围内，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）和沙门氏菌（Salmonella）是最为常见的三种引起食物中毒的致病菌。许多食品中，尤其是水产品中可能同时存在该三种致病菌，严重威胁着人们的生命财产安全。因此建立快速准确、灵敏、特异的多重检测技术至关重要。随着生物技术的不断发展，除传统培养法外，许多新技术已应用于病原菌的检测。其中，核酸扩增技术（Nucleic acid amplification technology,NAAT）可以从样品中检测出痕量目标分子，具有扩增速度快、灵敏高、特异性强等诸多特点，是食源性致病菌检测的重要技术手段。但是传统的核酸扩增技术如聚合酶链式反应（PCR）通常需要精密的仪器设备和专业的操作人员，且耗时相对较长，并不适用于现场快速检测。本研究将RPA技术应用于多重核酸检测技术中，与侧流免疫层析技术结合建立多重LFD-RPA体系，实现食源性致病菌多靶标同步快速检测。
本研究以金黄色葡萄球菌nuc基因（GenBank登录号:EF529607.1）、副溶血性弧菌toxR基因（GenBank登录号:GQ228073.1）、沙门氏菌fimY基因（GenBank登录号:JQ665438.1）为检测的目的基因设计RPA特异性引物。通过实验，确定金黄色葡萄球菌RPA上游引物标记生物素（Biotin）、副溶血性弧菌RPA上游引物标记羧基荧光素（FAM）、沙门氏菌RPA上游引物标记Cy5，三组RPA下游引物均标记地高辛（Digoxin）。经过系列多重RPA反应体系优化实验，确定最终多重RPA反应体系如下：基础缓冲液（含dNTPs）25μL、10μM金黄色葡萄球菌上下游引物各2μL（终浓度400nM）、10μM副溶血性弧菌上下游引物各0.75μL（终浓度1500nM）、10μM沙门氏菌上下游引物各2μL（终浓度400nM）、三种致病菌DNA模板各1μL、酶10μL、280mM醋酸镁2.5μL，最佳反应温度为37℃，最适反应时间为10min。特异性实验结果显示，多重LFD-RPA技术特异性强，只能检出目标致病菌，且三种目标致病菌之间无交叉反应，与其它食源性致病菌也不存在交叉扩增。灵敏度实验结果表明，多重LFD-RPA方法检测灵敏度高，金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌检测限分别为2.6×101CFU/mL、7.6×101CFU/mL、1.3×101CFU/mL。结合TSR-200胶体金读数仪读数结果绘制标准曲线金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌标准曲线R2分别为0.9903、0.9928、0.9945。
人工污染样品检测实验中，多重LFD-RPA方法检测人工污染食物样品中的金黄色葡萄球菌，副溶血性弧菌和肠炎沙门氏菌的检出限分别为4.5×101CFU/mL、8.3×101CFU/mL和2.7×101CFU/mL。对应的添加回收率分别为92-106.22%，93.73-107.59%和92.96-106.66%。实际样品检测实验中，分别使用多重LFD-RPA和传统培养法检测123个食物样品。结果显示，金黄色葡萄球菌的阳性检出率均为0%。本地市场样本和舟山出入境检验检疫局样本中副溶血性弧菌和肠炎沙门氏菌的阳性检出率均分别为1.9%和0%。
本研究将RPA扩增和侧流免疫层析试纸条结合，建立多重LFD-RPA方法同时检测金黄色葡萄球菌，副溶血性弧菌和沙门氏菌。此外，为了突破试纸条无法进行定量检测的瓶颈，尝试使用了胶体金读数仪（TSR-200）来扫描和分析试纸条测试线上的彩色信号，对多重LFD-RPA定量化检测进行初步实验。同时，胶体金读数仪的使用减轻了肉眼读数的误差，提高了准确性。除此之外，它还成功地应用于实际食物样品检测。多重LFD-RPA测检测是一种快速，便携，高灵敏度、高特异性的技术，且操作简单，无需复杂仪器,它将有助于食源性病原体的现场快速检测，为资源匮乏地区食源性致病菌的快速检测提供了新的思路，具有广泛的应用前景。
本研究以金黄色葡萄球菌nuc基因（GenBank登录号:EF529607.1）、副溶血性弧菌toxR基因（GenBank登录号:GQ228073.1）、沙门氏菌fimY基因（GenBank登录号:JQ665438.1）为检测的目的基因设计RPA特异性引物。通过实验，确定金黄色葡萄球菌RPA上游引物标记生物素（Biotin）、副溶血性弧菌RPA上游引物标记羧基荧光素（FAM）、沙门氏菌RPA上游引物标记Cy5，三组RPA下游引物均标记地高辛（Digoxin）。经过系列多重RPA反应体系优化实验，确定最终多重RPA反应体系如下：基础缓冲液（含dNTPs）25μL、10μM金黄色葡萄球菌上下游引物各2μL（终浓度400nM）、10μM副溶血性弧菌上下游引物各0.75μL（终浓度1500nM）、10μM沙门氏菌上下游引物各2μL（终浓度400nM）、三种致病菌DNA模板各1μL、酶10μL、280mM醋酸镁2.5μL，最佳反应温度为37℃，最适反应时间为10min。特异性实验结果显示，多重LFD-RPA技术特异性强，只能检出目标致病菌，且三种目标致病菌之间无交叉反应，与其它食源性致病菌也不存在交叉扩增。灵敏度实验结果表明，多重LFD-RPA方法检测灵敏度高，金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌检测限分别为2.6×101CFU/mL、7.6×101CFU/mL、1.3×101CFU/mL。结合TSR-200胶体金读数仪读数结果绘制标准曲线金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌、沙门氏菌标准曲线R2分别为0.9903、0.9928、0.9945。
人工污染样品检测实验中，多重LFD-RPA方法检测人工污染食物样品中的金黄色葡萄球菌，副溶血性弧菌和肠炎沙门氏菌的检出限分别为4.5×101CFU/mL、8.3×101CFU/mL和2.7×101CFU/mL。对应的添加回收率分别为92-106.22%，93.73-107.59%和92.96-106.66%。实际样品检测实验中，分别使用多重LFD-RPA和传统培养法检测123个食物样品。结果显示，金黄色葡萄球菌的阳性检出率均为0%。本地市场样本和舟山出入境检验检疫局样本中副溶血性弧菌和肠炎沙门氏菌的阳性检出率均分别为1.9%和0%。
本研究将RPA扩增和侧流免疫层析试纸条结合，建立多重LFD-RPA方法同时检测金黄色葡萄球菌，副溶血性弧菌和沙门氏菌。此外，为了突破试纸条无法进行定量检测的瓶颈，尝试使用了胶体金读数仪（TSR-200）来扫描和分析试纸条测试线上的彩色信号，对多重LFD-RPA定量化检测进行初步实验。同时，胶体金读数仪的使用减轻了肉眼读数的误差，提高了准确性。除此之外，它还成功地应用于实际食物样品检测。多重LFD-RPA测检测是一种快速，便携，高灵敏度、高特异性的技术，且操作简单，无需复杂仪器,它将有助于食源性病原体的现场快速检测，为资源匮乏地区食源性致病菌的快速检测提供了新的思路，具有广泛的应用前景。