目的:颈椎病是老年人常见的颈椎慢性退行性疾病,其表现出神经根受压迫所引起的临床症状,严重影响着大多数患者的正常生活。然而到目前为止,颈椎病的发病机制尚不完全清楚。本研究拟通过检测颈椎病患者髓核组织细胞凋亡情况以明确髓核细胞凋亡与颈椎病发生发展程度,同时检测TNF-α炎性因子刺激下髓核细胞凋亡相关基因表达情况,以明确在慢性退行性疾病过程中,Trim14、NF-κB p65以及PPM1A的表达与髓核细胞凋亡的相关性,并明确其中调控机制。方法:1.取颈椎病患者和非颈椎病患者髓核组织进行组织切片染色,利用HE染色明确颈椎病患者髓核组织结构变化,同时利用Tunnel染色,以明确在颈椎病患者中,髓核组织的凋亡与颈椎病发病的相关性。同时分离提取人髓核组织中的髓核细胞,在TNF-α炎性因子诱导下,检测髓核细胞活性和凋亡情况,明确炎性因子对髓核细胞凋亡的影响。2.取人髓核细胞,在不同浓度的TNF-α炎性因子诱导下提取人髓核细胞m RNA和蛋白,通过q RT-PCT以及Western Blot检测TNF-α炎性因子诱导下Trim14、NF-κB P65的表达情况以及磷酸化水平。以明确在人髓核细胞中,TNF-α炎性因子通过影响哪些因子表达改变从而影响髓核细胞的凋亡。3.构建Trim14干扰质粒和过表达质粒,通过增加和降低人髓核细胞Trim14表达,检测人髓核细胞凋亡相关基因表达和凋亡流式细胞检测,明确其在TNF-α炎性因子诱导下对人髓核细胞凋亡的影响。同时检测其对NF-κB P65的影响,以明确Trim14对NFκB P65的调控机制。4.在人髓核细胞中加入Trim14干扰质粒用以干扰Trim14表达,检测PPM1A、PPM1B表达量,以明确Trim14对磷酸酶调控作用,之后通过co IP技术,明确Trim14与PPM1A蛋白关系,之后检测PPM1A泛素化水平,明确TNF-α炎性因子通过Trim14对PPM1A活性的影响。5.取颈椎病患者和非颈椎病患者髓核组织,提取其m RNA检测TNF-α、Trim14、PPM1A、NF-κB P65表达情况,以明确颈椎病发病过程中这些因子表达改变情况。实验结果:1.取颈椎病患者和非颈椎病患者髓核组织进行组织切片染色发现,在颈椎病患者的髓核组织中,凋亡小体显著增加。提取髓核细胞,在不同浓度的TNF-α炎性因子诱导下,显著抑制髓核细胞的活性,促进其凋亡。表明在髓核组织中,髓核细胞凋亡显著增加,可能由于TNF-α炎性因子含量增加所致。2.不同浓度TNF-α处理的人髓核细胞可以显著促进NF-κB p65的表达水平和磷酸化水平,同时也促进了Trim14的表达,这提示Trim14可能参与NF-κB p65的表达和磷酸化。3.采用Trim14干扰质粒干扰人髓核细胞Trim14表达发现,显著抑制TNF-α炎性因子诱导的髓核细胞凋亡情况,其中Bcl2表达量显著增加,Bax蛋白表达量显著降低,同时,干扰Trim14表达之后,降低了NF-κB p65表达量和磷酸化水平。之后采用过表达质粒增加Trim14表达发现,显著增加了TNF-α炎性因子诱导的髓核细胞凋亡情况,其中Bcl2表达量显著降低,Bax蛋白表达量显著增加,同时,增加Trim14表达之后,增加NF-κB p65表达量和磷酸化水平。表明Trim14在TNF-α炎性因子作用下显著增加,从而通过促进NF-κB p65表达量和磷酸化水平上升而加速髓核细胞的凋亡。4.采用Trim14干扰质粒干扰人髓核细胞Trim14表达发现,TNF-α作用下,可以显著增加PPM1A表达量,同时我们利用co-IP检测发现,Trim14可以促进PPM1A的泛素化水平,进而抑制PPM1A的去磷酸化能力,增加NF-κB的磷酸化水平,从而激活NF-κB信号通路增加凋亡基因的表达,促进人髓核细胞的凋亡发生。5.在严重颈椎病患者的髓核组织中,TNF-α、Trim14、NF-κB表达量显著增加,同时PPM1A表达量显著下降。结论:总之,我们的研究明确,颈椎病患者髓核组织细胞凋亡显著增加,这可能与炎性因子TNF-表达增加激活Trim14/PPM1A/NF-κB p65调控途径有关,这进一步明确颈椎病发病机制,同时也为临床治疗颈椎病的发生提供新的思路。