背景:先天性心脏病（Congenital heart disease,CHD）是全球范围内最常见的先天性出生缺陷,是由胚胎发育过程中心脏形成障碍而引起的结构和功能异常,发病率约1%且占出生缺陷的28%左右,是造成婴幼儿死因或残疾的主要原因之一。在我国,据卫生部2012年出生缺陷防治报告统计,先天性心脏病已成为我国围产期第一位顺位高发畸形,中国每年有18～22万先天性心脏病新生患儿。法洛四联症（Tetralogy of Fallot,TOF）是先天性心脏病其中一种亚型,属于青紫型心脏病,出生患病率约1/3000,占全部先天性心脏病的5%,其是由于胚胎时期圆锥动脉干发育异常所致,是指由室间隔缺损;主动脉骑跨;肺动脉狭窄;右心室肥厚4种表型联合的心脏畸形。与其他亚型相比,法洛四联症患儿常出现严重缺氧、肺炎等其他的合并症。法洛四联症自然预后不佳,患者若未能及时诊断治疗则在成年期时会有高达约90%的病死率。随着外科修复术的不断发展进步,法洛四联症目前能够得到手术矫正,但与此同时,造成的长期不良预后包括右心室搏动异常以及心源性猝死等,仍然给患者家庭和社会造成沉重的经济和心理负担。心脏发育是一个极其复杂的过程,整个发育过程涉及一系列复杂且特异的信号通路及转录级联调控。既往报道表观遗传修饰相关基因在先天性心脏病的发生发展中发挥重要作用。表观遗传修饰是指所有细胞有丝分裂或减数分裂在基因表达或者表型上的可遗传性改变,其包括DNA甲基化（DNA methylation）,RNA 甲基化（RNA methylation）,组蛋白修饰（Histone modification）,染色质重建（Chromatinremodeling）等,表观遗传修饰除了在转录水平上,还能在转录后水平和翻译水平上对基因表达发挥重要的调控作用。既往对362例各种先天性心脏病亚型患者及其健康父母进行全外显子测序研究发现,基因突变显著富集于H3K4和H3K27关键组蛋白修饰相关基因,从而在转录水平调控心脏发育相关重要基因,导致心脏发育缺陷。近年来,表观遗传学修饰在RNA领域方面相关研究蓬勃发展,其主要通过转录后修饰参与调控mRNA翻译过程。目前已收录的RNA的修饰约有112种,大部分RNA修饰发生在tRNA,mRNA和rRNA上,小部分发生在snRNA,miRNA等小RNA上。而RNA甲基化占到所有修饰的60%以上,其中5-甲基胞嘧啶（C5-methylcytidine,m5C）是一种广泛存在于RNA中的甲基化修饰形式,约占所有RNA甲基化修饰的9.6%。很多古细菌以及真核生物的tRNA中都已经被证实通过m5C修饰影响氨酰化的形成及密码子的识别。m5C修饰还存在于rRNA结合tRNA发挥翻译活性的区域。更为重要的是m5C修饰在mRNA有显著富集,主要分布于GC富集区域且在不同组织中对于所修饰的基因具有特异性。m5C修饰可能会调控mRNA的选择性剪切;m5C修饰水平可能会影响外显子的保留水平以及转录本的组装形式;m5C的富集还提示其可能与蛋白质翻译有较为密切的关系;除此之外,m5C可能和mRNA的稳定性有关,含有m5C修饰的mRNA的稳定性较强,而m5C水平的降低可以导致mRNA的稳定性降低;m5C修饰可能还会影响microRNA参与的RNA降解途径。近年来,m5C相关研究早已成为表观遗传学修饰的研究热点。随着研究的深入,越来越多的研究发现m5C修饰涉及多种生物学功能。目前研究主要集中在m5C的甲基修饰酶,而其中NSUN蛋白家族被研究最为广泛。人的NSUN家族共有9个基因,其与胚胎发育过程关系密切。近年来有研究发现NSUN2蛋白作为mRNA m5C甲基转移酶,其敲除小鼠体型偏小且包括皮肤等的特异性组织后期发育受到延迟或阻碍;在小鼠睾丸发育过程中,NSUN2介导的m5C修饰参与生殖发育调控。此外,除了 NSUN蛋白家族,也有研究发现了m5C修饰通过其酶基因Ybx1维持母源mRNA稳定性从而保证母源-合子转换有序进行,最终促进早期胚胎发育进程,Ybx1缺失导致早期胚胎发育阻滞在囊胚期和原肠期。这些研究都为RNA甲基化酶基因介导的m5C修饰与胚胎发育密切相关提供了证据。据研究报道,染色体7q11.23区域缺失能引起心脏流出道发育的缺陷,例如法洛四联症。该区域包含了 25个编码包括转录调控因子,信号分子以及其他在各种细胞过程中发挥作用的基因。在这25个基因中,BAZ1B、EIF4H、ELN和NSUN5四个基因在人和小鼠胚胎心脏中均有特异性表达,提示可能在心脏发育过程中发挥作用。最新的研究表明,BAZ1B与7q11.23缺失患者的甲状腺功能减退相关,EIF4H与7q11.23区域缺失患者肌萎缩侧索硬化有关,ELN基因被证实是导致7q11.23区域缺失患者的主动脉瓣上狭窄的原因。NSUN5基因编码RNA m5C甲基转移酶,其被报道参与胚胎发育过程。通过构建Nsun5小鼠敲除动物模型,发现Nsun5缺失能够引起少突胶质细胞前体细胞发育受损以及功能紊乱,从而抑制神经元细胞活性,导致大脑发育缺陷和认知能力的下降;胼胝体体积缩小并且伴有髓轴突数目减少及髓鞘松脱,主要表现在空间认知能力的受损;此外还发现NSUN5与大脑皮层发育相关,产后10天Nsun5敲除小鼠皮质厚度明显变薄,包含大量异常的层状组织,锥体细胞突起变短变细。以上研究都证实了NSUN5在胚胎发育过程中的关键作用。上述研究结果表明了NSUN5在人和小鼠胚胎心脏中均有特异性表达,提示可能在心脏发育过程中发挥作用,且7q11.23区域具体对应的基因缺失引起心脏流出道发育的缺陷至今仍未知。因此我们推测NSUN蛋白家族的NSUN5基因可能与7q11.23区域缺失引起心脏流出道发育的缺陷相关。为了深入研究5-甲基胞嘧啶修饰酶基因NSUN5突变与法洛四联症发病关联和生物学功能,本研究采用系统流行病学方法,联合流行病学、细胞生物学、分子生物学等多个学科手段对NSUN5突变在法洛四联症发生中的关联和功能进行探讨。方法:本研究共纳入132例法洛四联症患者以及2000例来自同一地区、无出生缺陷和心脏疾病的正常对照,参考人类基因组（GRCh37/hg19）中NSUN5编码区序列,引物设计采用Primer 3（v.0.4.0）在线设计软件引物,Sanger测序检测突变数目并利用突变评价软件Combined Annotation Dependent Depletion（CADD）得到功能性突变,通过Fisher’s确切概率法检测NSUN5有害突变在法洛四联症患者中的携带频率以及富集程度。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Nsun5敲除小鼠动物模型,验证Nsun5敲除对于心脏流出道发育影响;通过免疫荧光实验,检测Nsun5敲除对于心脏流出道及其他部位细胞增殖的影响;利用RNA甲基化测序以及蛋白质谱等研究手段,检测m5C修饰水平的变化以及转录后差异蛋白,探索Nsun5在心脏流出道发育过程中的调控机制。结果:本研究发现NSUN5编码区4个潜在功能性突变并在法洛四联症患者中显著富集（P=1.44×10-5）,提示功能性突变与法洛四联症发生有显著关联。进一步通过生物信息学注释,发现c.219221delAAG（p.K65del）位于保守区域内,高度保守的序列区域在生物进化上会发挥十分重要功能作用,该突变使得NSUN5阅读框内移码,造成变构效应而导致保守区域序列破坏,从而引起NSUN5功能损害;c.324G>T（p.A100S）位于C5-甲基化酶及RsmB/RsmF结构域,该功能域主要作用核糖体RNA,从而使得mRNA分子在其上展开,实现蛋白质的合成,该错义突变经过生物功能学预测有害,能够破坏该结构功能域功能,从而导致NSUN5功能失活,使得各种发挥重要生物学功能的mRNA分子不能在核糖体RNA上展开,造成蛋白质合成障碍;c.12361240delTGCCT（p.CL404fs*5）位于S-腺苷甲硫氨酸依赖性甲基转移酶结构域,该结构域是发挥m5C修饰的重要区域,保证m5C能够在各类RNA上修饰,从而发挥生物学功能,移码突变可能造成该功能结构域破坏而导致NSUN5功能失活,使得m5C在各类RNA上修饰发生异常;c.13701373delAGAA（p.KE448fs*17）位于NSUN5基因末端,基因末端的移码突变可能造成突变后续的氨基酸发生改变,引起转录终止密码子失效,从而导致NSUN5蛋白易降解。为了进一步探索NSUN5功能缺失在法洛四联症发生过程中的功能,我们利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Nsun5敲除小鼠动物模型,将Nsun5杂合敲除的小鼠进行交配,在出生后第一天（Postnatal day one,P1）对各个基因型的小鼠进行统计,结果显示新生小鼠的三种基因型不符合孟德尔遗传比例,各个基因型的小鼠数目分别为,野生型41只,杂合敲除87只,纯合敲除25只。Nsun5纯合敲除小鼠比例显著下降,纯合敲除小鼠可能存在胚胎致死的现象。胚胎发育第14.5天（Embryonic day 14.5,E14.5）是小鼠胚胎心脏流出道分隔发育完成的时间点,在E14.5天对各个基因型的胚胎进行统计,我们发现各个基因型的胚胎数量分布符合孟德尔遗传比例。以上结果提示胚胎致死发生于E14.5-P1天之间,推测原因之一可能是流出道发育迟缓导致。在胚胎发育期间,流出道主动脉分隔是从左心室连接,E14.5天胚胎心脏切片的苏木精-伊红（Hematoxylin-eosin,H&E）染色结果表明,Nsun5敲除样本中,流出道主动脉分隔是从右心室连接,左右心室间隔存在缺损,提示敲除小鼠中心脏流出道发育异常迟缓。对于胚胎心脏流出道结构观测及统计显示,42.2%（27/64）敲除小鼠中流出道发育迟缓,其频率明显高于野生型小鼠（13.8%,8/58）,具有统计学差异（P=0.001）。而作为流出道系统组成部分的室间隔在Nsun5敲除样本中厚度显著减小,该结果提示造成这一表型可能与细胞增殖相关。进一步的免疫荧光染色表明,对于细胞增殖相关指标Ki67和EdU,其在Nsun5敲除样本流出道和室间隔阳性细胞显著减少。综上,在Nsun5敲除E14.5天胚胎中所见的心脏流出道发育迟缓可能与胚胎发育期间心脏组织中细胞增殖缺陷相关。斑点杂交实验结果表明,E14.5天NSUN5敲除心脏组织中RNA m5C水平显著下降。通过m5C的RNA甲基化测序,筛选得到了在E14.5天Nsun5野生型和敲除心脏中存在m5C差异修饰位点的基因集,这些基因主要富集在横纹肌发育,心肌组织发育,心肌组织形态等通路,这些通路都与心脏发育的发生和发展相关,提示Nsun5敲除后m5C差异修饰位点所在基因与上述生物学通路功能密切相关。通过蛋白质谱实验,我们筛选了 E14.5天Nsun5野生型和敲除心脏中存在差异表达蛋白,这些蛋白主要富集在横纹肌细胞分化,心肌组织发育等通路,这些通路也都与心脏发育的发生和发展相关,提示Nsun5敲除后差异表达蛋白与上述生物学通路功能密切相关。本研究将m5C差异修饰位点所在基因和差异表达蛋白进行了合并筛选,得到Tpm1可能为Nsun5潜在下游调控基因,Tpm1是心脏发育所需且在发育早期的心脏组织高表达,同时参与调控细胞增殖。我们进一步发现了Tpm1 m5C整体修饰强度下降且在E14.5天Nsun5敲除胚胎心脏中存在4个显著下降的m5C修饰位点。通过免疫荧光实验,Tpm1在E14.5天小鼠心脏流出道表达并且敲除小鼠中的Tpm1的荧光强度显著下降,结果提示Nsun5介导的m5C修饰影响下游Tpm1表达。最后,我们对E14.5天Nsun5野生型和敲除心脏进行了 RNA全转录组测序,筛选了差异表达基因,这些基因富集在发育细胞生长通路,提示差异表达基因与细胞增殖相关。综上结果提示Nsun5缺失使得Tpm1 mRNA的m5C修饰水平下降,从而使得Tpm1翻译效率降低,可能导致细胞增殖减缓。结论:本研究运用流行病学方法系统鉴定到法洛四联症患者NSUN5功能性突变富集,潜在功能性突变坐落于发挥NSUN5功能的重要位置或功能结构域,造成NSUN5功能失活,引起m5C在心脏发育重要基因上修饰发生异常或蛋白质合成障碍,从而造成法洛四联症相关的流出道发育异常。生物功能学实验证实了Nsun5缺失能够引起法洛四联症相关的流出道发育迟缓,其通过调节m5C修饰水平影响潜在下游基因Tpm1表达,导致心脏组织中细胞增殖减缓所实现,提示Nsun5/Tpm1信号轴在心脏流出道发育中的重要性。本研究结果提示了酶基因NSUN5和m5C修饰在心脏发育中所发挥的重要作用,为法洛四联症遗传学病因探索及其发生机制提供了新的思路。