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生物材料植入体内通常会引起机体的早期免疫反应,炎症程度的高低对组织愈合有着重要影响,其中材料表面的形貌对这一现象有重要的调控作用。钛表面TiO2纳米管结构具有与骨胶原结构相似的仿生形貌,并且管径结构为药物加载提供平台。课题组前期的研究发现直径约100 nm的大管径纳米管能促进骨髓间充质干细胞的成骨分化,但同时会诱导巨噬细胞向M1型极化,加重炎症反应,不利于成骨改建。鉴于此,本研究拟通过制备载药涂层的方式来改变大管径纳米管的促M1极化的作用,使其向利于组织修复的M2型极化。在巨噬细胞M2极化的激活剂中地塞米松是常见的小分子药物,被广泛的应用于临床。DNA水凝胶是一种生物相容性良好的药物递送系统,其三维网络状的内部结构能容纳大量的药物分子,而且具有一定的流动性,有利于进入纳米管中。因此,本研究在钛纳米管表面构建了以壳聚糖为交联剂的新型DNA水凝胶涂层来递送地塞米松,并对巨噬细胞极化的调控作用进行了体内外研究,以期为种植体表面形貌修饰提供新的思路。【目的】1.利用正负电荷相互吸引的原理,使用质子化后带正电荷的壳聚糖作为交联剂,与双链DNA骨架上带负电荷的磷酸基团之间结合,制备DNA物理水凝胶。2.在大管径TiO2纳米管的管腔和表面加载DNA水凝胶来制备涂层,作为M2型巨噬细胞激活剂地塞米松的递送载体。3.探索负载地塞米松的DNA水凝胶涂层对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞极化方向的影响,并通过小鼠体内植入实验进一步验证。【方法】1.采用简单混匀的制备方法,观察不同浓度的壳寡糖、壳聚糖纳米粒、壳聚糖与DNA的成胶情况,并通过肉眼观察、拍照、SEM、XRM、FTIR、XPS、旋转流变仪和体外降解实验,对其大体性状、表面形貌、内部结构、结合方式、流变特性、溶胀性和降解性进行研究。2.采用酸蚀加阳极氧化的方法制备大管径钛纳米管,再通过真空抽吸的方法,在钛纳米管表面制备负载地塞米松的DNA水凝胶涂层,使用SEM、EDS和体外药物释放实验对其进行表征。3.将RAW264.7细胞接种于NT、NT+Gel、NT+Dex@Gel三组钛试样表面,通过CCK-8、SEM、免疫荧光染色、ELISA和RT-qPCR检测巨噬细胞增殖和M1、M2型巨噬细胞标志物在蛋白和基因水平的表达情况。4.将钛试样植入小鼠腹腔,通过ELISA检测小鼠腹腔冲洗液中M1、M2型巨噬细胞标志物的浓度。【结果】1.在壳寡糖、壳聚糖纳米粒、壳聚糖三种交联剂中,分子量为100～300 kDa的壳聚糖溶液可以与2 wt%DNA形成质地均一的透明状水凝胶,SEM和XRM显示其表面和内部均为网络状多孔结构,其孔径随壳聚糖浓度的增加而减小;FTIR光谱图中磷酸基团峰形的改变和XPS结果中P、O元素周围电子环境的改变,说明壳聚糖是通过静电作用与DNA分子中的磷酸基团结合的;流变学分析、溶胀性研究以及大体观察结果显示该凝胶具有剪切稀释的特性、可注射性、自支撑性和较高的溶胀率,其中0.5%壳聚糖组形成的凝胶物理性状比较好,用作后续生物学实验。2.采用阳极氧化法制备的钛纳米管,形状规则、排列有序,管径约为100 nm。采用抽真空的方法将DNA水凝胶加载到纳米管表面制备涂层,SEM显示凝胶在纳米管表面形成了薄层,并进入到纳米管的管腔和管间隙中;纳米管的纵剖面EDS元素分析中C元素含量升高,并出现了N元素,说明管腔中含有凝胶;地塞米松的体外释放试验结果显示DNA凝胶涂层延缓了地塞米松的释放,将其半数释放量的天数从2天提高到4.5天。3.将RAW264.7细胞接种于NT、NT+Gel、NT+Dex@Gel三组钛试样表面后,SEM下细胞生长状态良好,第5天时,NT+Dex@Gel组出现长梭形巨噬细胞。CCK-8结果显示,第3、5天时NT+Gel组细胞活性显著强于NT组,第1、3、5天时NT+Dex@Gel组细胞活性显著强于NT和NT+Gel组,说明凝胶涂层对细胞增殖有一定促进作用,地塞米松能进一步加强该促细胞增殖作用。与NT和NT+Gel组相比,NT+Dex@Gel组的免疫荧光染色结果中CD86荧光强度显著降低、CD163荧光强度显著升高;RT-qPCR结果中M1极化标志物CD86和CCR7的mRNA表达水平显著降低、M2极化标志物CD163和TLR-1的mRNA表达水平显著升高;上清液的ELISA结果中M1极化标志物TNF-α的蛋白含量显著降低、M2极化标志物CCL16和CXCL13的蛋白含量显著升高。4.将三组钛试样植入小鼠腹腔3天时,与NT和NT+Gel组相比,NT+Dex@Gel组的腹腔冲洗液中M1极化标志物CD86、CCR7、TNF-α、IL-6蛋白浓度降低,M2极化标志物CD163、TLR-1、CCL16、CXCL13蛋白浓度升高。【结论】壳聚糖可交联DNA骨架形成新型DNA物理水凝胶,通过抽真空的方法将其加载于钛纳米管的表面和管腔中制备涂层来递送地塞米松,体外实验中能促进巨噬细胞的增殖和M2极化相关标志物的表达、抑制M1极化相关标志物的表达,小鼠体内植入试验进一步验证了该结论,从而减轻炎症反应,有利于早期骨结合的形成。