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2型糖尿病（T2DM）是一种常见的慢性代谢性疾病,T2DM患者骨脆性增加、骨折风险显著升高等问题导致其致残率和致死率增高,造成了巨大的经济和社会负担。骨组织能够改变自身的结构以适应外界应力刺激的变化,适度应力刺激对于维持骨骼健康必不可少。然而,T2DM骨骼响应应力刺激的能力及其合成代谢变化特征,国内外鲜有报道。因此,深入研究T2DM的骨骼力学敏感性是否衰退及其潜在机制对于提高患者的生活质量、减轻社会经济负担具有重要意义。钙是体内重要的信号分子,细胞受到刺激时胞内钙浓度会在内外环境梯度的作用下产生动态变化,从而传递信号（即钙信号）。钙信号被证实是骨响应外源性刺激产生的胞内早期生化反应事件,能诱发后续的信号级联反应。骨细胞（OCY）是骨中主要的力学感应细胞,能响应应力调节骨吸收和骨形成过程。OCY以独特的钙信号编码外源性力学刺激,课题组前期研究发现OCY响应应力刺激时呈现多尖峰钙振荡特征。但T2DM骨组织原位OCY在应力作用下的钙信号特征尚未见相关报道。本研究首先通过硬件设计及LabVIEW编程,构建了闭环反馈式小动物长骨轴向压缩应力加载系统。基于该系统,确定小鼠生理性轴向压缩载荷模型的构建参数,为研究正常与T2DM骨骼应力敏感性的差异奠定了基础。其次,对正常和T2DM小鼠施加生理性轴向压缩周期载荷刺激,系统比较其骨量、骨微结构、骨组织形态学、骨代谢和OCY活性功能的变化,发现T2DM骨骼应力敏感性衰退,表现为其在应力作用下无明显骨适应性改变。第三,比较周期载荷作用下正常和T2DM小鼠原位胫骨的OCY钙信号特征,发现T2DM骨骼内OCY无钙振荡现象。过表达SERCA后T2DM骨内OCY钙信号响应得到明显改善。本研究系统比较了正常小鼠与T2DM小鼠骨骼力学敏感性的差异,探索了应力作用下T2DM骨骼原位OCY的钙响应特征,为进一步了解T2DM骨骼力学信号转导机制提供了实验依据。本课题由以下三个部分组成:第一部分:新型闭环反馈式小动物长骨轴向应力加载模型的构建及参数优化背景:课题组此前研制的应力性骨折动物模型构建装置存在峰值压力不稳定、加载频率范围较小等问题,不能满足本研究的实验需求。本研究旨在构建新型闭环反馈式小动物长骨轴向应力加载系统,并基于此平台确定小鼠生理性轴向压缩载荷模型的构建参数。方法:使用力学传感器、数据采集卡、组织固定模块、伺服电机、电机控制器、应变调理器等部分构成加载系统的硬件主体,并基于LabVIEW软件设计一套控制程序以实现计算机对应力加载装置的精准控制。分别对小鼠胫骨和尺骨施加不同峰值的载荷刺激,筛选使小鼠骨量和骨微结构改善最为明显的参数。结果:该系统能实时检测骨骼承受的压力及骨表面的应变,可模拟生理状态下施加于骨骼的机械应力。系统可自动调节峰值压力,确保施加载荷的精确性和稳定性,同时系统的加载频率范围扩大,为开展多参数实验提供了平台。以小鼠胫骨为加载对象,9 N为加载峰值时,小鼠小梁骨骨量和骨微结构改善最为明显。结论:新型闭环反馈式小动物长骨轴向应力加载系统的构建及动物模型参数优化为系统地比较正常小鼠与T2DM小鼠的骨骼应力敏感性差异提供了科学的实验平台和重要的实验依据。第二部分:正常小鼠和T2DM小鼠骨骼应力敏感性差异的实验研究背景:T2DM患者骨骼力学属性下降,骨折风险显著增加,导致其致残率和死亡率升高。生理性机械应力对于骨骼健康至关重要,应力不足会导致骨量下降。T2DM骨骼响应应力刺激的能力及其合成代谢变化特征,国内外尚未见相关报道。方法:构建自发性和诱发性T2DM小鼠模型,对正常和T2DM小鼠胫骨施加生理性轴向压缩载荷刺激,通过Micro-CT、荧光双标、甲苯胺蓝染色、TRAP染色、H＆E染色、免疫组化染色等方法比较正常和T2DM骨骼在应力作用下加载侧和对照侧胫骨的骨量、骨微结构、骨组织形态学、骨代谢及OCY活性和功能的差异。结果:生理性轴向载荷刺激显著改善了正常小鼠的骨量和骨微结构,促进其成骨细胞功能并抑制破骨细胞生成,减少了OCY骨陷窝空腔数目和Caspase-3的表达,抑制了OCY分泌的Sclerostin和RANKL的表达,增加了OPG的表达。然而,生理性应力载荷并未显著改变T2DM导致的骨量、骨微结构、骨组织形态学、骨代谢以及OCY活性和功能的恶化。结论:T2DM骨骼应力敏感性衰退,其响应机械应力的骨合成代谢作用减弱,T2DM骨内OCY感受和响应应力调控骨代谢的能力下降,本研究进一步丰富了人们对于T2DM骨骼生物力学的认识。第三部分:正常和T2DM小鼠骨组织原位骨细胞应力钙信号响应及机制研究背景:OCY是骨骼中感受机械应力的核心细胞,正常骨骼的OCY在应力作用下呈现出独特的多尖峰钙振荡波形。但T2DM骨骼中OCY响应应力刺激具有怎样的钙信号特征,应力作用下OCY钙响应的变化是否会介导T2DM骨骼力学敏感性降低,这些问题亟待研究。方法:基于激光共聚焦采集与应力加载同步技术,比较正常和T2DM骨骼原位OCY在周期载荷作用下的钙信号特征是否存在差异。通过体外实验,检测高糖环境对MLO-Y4细胞SERCA基因水平的影响。通过免疫组化染色观察T2DM小鼠胫骨OCY内SERCA2的表达情况。过表达T2DM胫骨原位OCY内SERCA,观察OCY钙响应的变化。结果:T2DM胫骨原位OCY在应力作用下仅能产生少量钙尖峰,无钙振荡现象。高糖条件下MLO-Y4细胞中SERCA编码基因和T2DM小鼠胫骨OCY内SERCA2的表达均减少。过表达SERCA后T2DM胫骨原位OCY表现出多尖峰钙振荡,OCY钙信号响应明显改善。结论:T2DM胫骨原位OCY响应外界应力刺激时钙信号响应受损,而SERCA异常是影响T2DM骨骼OCY力学信号转导的一个关键原因,本研究为进一步深入了解T2DM骨骼力学信号转导机制奠定了基础。