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为了从分子水平研究自噬与凋亡之间的关系,本实验进行了hAPG5基因的克隆和表达,应用PCR技术,从人胚脑cDNA文库和B细胞cDNA文库中钓取APG5基因,测序确定核苷酸序列并进行生物信息学分析。以APG5为模板进行数据库搜索,将相关克隆的基因组序列做相似性比对,用DOTPLOT方法确定其相互位置关系,并进行序列拼接,得到全长为144159bp人类APG5基因基因组全序列,确定其有八个外显子。根据剪切位点的特性找出其在序列中的位置,分别计算出内含子、外显子的长度,首次证实并报道APG5β是第三外显子缺失的可变性剪切变异体。登录号(hAPG5β;LOCUS AF293841,Genbank)。利用脂质体LIPOFACTIN将pEGFP-ClAPG5/APG5β载体转入人肝细胞株和Hela细胞株。在共聚焦激光显微镜下观察两者的表达发生在凋亡的细胞。在凋亡诱导刺激下表达随凋亡出现而时间前移。APG5系统发育分析证明该基因从单细胞生物到多细胞生物一直保留,这种基因的水平传播说明其具有高度的保守性,是生命体功能所必需的重要基因。APG5与APG5β蛋白功能预测的比较分析发现,APG5β细胞定位预测在细胞外包括细胞膜(4.3%)和高尔基体(4.3%)有分布,缺少两个蛋白激酶C磷酸化位点和一个酪蛋白激酶磷酸化位点,少一个酪氨酸激酶磷酸化位点。采用4096条人类基因的cDNA芯片检测3-MA自噬抑制剂在凋亡诱导的人肝细胞株L02基因表达谱的改变。实验结果数据分析,151条表达差异基因中,74条表达上调;77条表达下调。APG5无表达差异。在诱导自噬和抑制自噬后凋亡诱导的细胞超微结构的变化中发现,不管诱导或抑制自噬,对凋亡的发生未产生明显的影响。其表现形式兼有两种细胞死亡的特点,即自噬性凋亡。同时发现凋亡小体的一种不同于出泡的形式的形态学改变--散离的形式解体,这是一种较出泡更为节省能量的解体形式。 实验结果证实,自噬程序性细胞死亡与凋亡是两条不同的程序性细胞死亡路径。在生理状态下,自噬是细胞为维持生存的主动过程。在病理状态下,自噬无能力清除损伤的细胞器才发展为细胞死亡。而凋亡是生命体主动以部分细胞的死亡来维持生存的主动过程。这是维持机体内环境稳定的两个动态定量平衡关系,它们在宏观与微观的不同层次,以有机地辅助体系完成生命活动的调控。自噬程序性细胞死亡与凋亡不是相互孤立的,在特定的条件下可以转化。APGS/APG56蛋白可能是一种细胞骨架蛋白,参与自噬体的包裹,在自噬发展为自噬性凋亡时,自噬体就可以成为凋亡小体,APGS/APG邓蛋白以一种特异凋亡蛋白表达。从两种细胞死亡的共同膜包裹行为可以看出,主动的细胞死亡是一种保护性机制,防止了内容物溢出而产生有害作用,有利于凋亡小体以散离的形式解体,因较出泡的形式更为节省能量。