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背景:抗微生物药物耐药性（Antimicrobial Resistance,AMR）已成为公共卫生领域的重大挑战。肺炎克雷伯杆菌（Klebsiella pneumoniae,KP）和鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii,AB）是我国G-杆菌中最常见的两类致病菌,属于超级细菌“ESKAPE”家族,可有效“逃离”（escape）现有抗菌药物的治疗活性,耐药形势极为严峻。其中,碳青霉烯耐药的KP（Carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP）检出率、致死率高,早期识别CRKP感染的危险因素并加以控制,对预防CRKP感染至关重要,但目前仍存在争议。多重耐药的AB（Multidrug resistant Acinetobacter baumannii,MDRAB）治疗选择有限,几乎仅对多黏菌素、替加环素（Tigecycline,TGC）等抗菌药物敏感。然而,单独应用这些敏感药物治疗MDRAB感染,存在一定的局限性。具体而言,多黏菌素类抗菌药物,如多黏菌素E（Colistin,COL）,单独用药时AB容易发生异质性耐药,从而导致治疗失败;TGC则血中暴露量不足,即使是对于敏感菌株所致血流感染也疗效欠佳,而肺部、腹腔等各种原发部位感染严重时往往会继发血流感染,这使得TGC的临床应用受到极大限制。联合用药可在一定程度上解决上述问题,一方面可降低AB发生COL异质性耐药的风险,另一方面可显著增强抗菌活性,使TGC治疗MDRAB血流感染成为可能。因此,本研究以CRKP和MDRAB为研究对象,一方面明确CRKP感染的危险因素及预后,另一方面以COL、TGC为基础,联合其他临床常见抗菌药物,探究对MDRAB具有协同效应的联合用药方案,从而为临床防治耐药G-杆菌感染提供理论依据。方法:1.ICU患者感染CRKP的危险因素及预后分析:采用回顾性观察方法,选择2017年-2020年中国人民解放军总医院呼吸科重症监护室（Intensive care unit,ICU）KP感染的住院患者为研究对象,根据碳青霉烯药敏结果分为CRKP组和碳青霉烯敏感KP（Carbapenem sensitive Klebsiella pneumoniae,CSKP）组,采用单因素和多因素logistic回归分析比较两组的临床特征及相关因素暴露史,得到CRKP感染的独立危险因素,并评价患者的临床转归。2.临床分离MDRAB的联合用药策略研究:（1）通过医院Pride病案系统明确4株多重耐药菌株AB034、AB239、AB536、AB767的临床背景。（2）全基因组测序阐明上述4株MDRAB的遗传背景,包括系统发育关系、多位点序列分型和耐药基因等。（3）微量肉汤稀释法测定临床常用抗菌药物COL、TGC、舒巴坦（Sulbactam,SUL）、阿米卡星（Amikacin,AMI）、美罗培南（Meropenem,MEM）、左氧氟沙星（Levofloxacin,LEV）、环丙沙星（Ciprofloxacin,CIP）、磷霉素（Fosfomycin,FOS）、利福平（Rifampin,RIF）对上述4株MDRAB的最低抑菌浓度（Minimum inhibitory concentration,MIC）。（4）棋盘法测定以COL、TGC为基础联合SUL、MEM、LEV、CIP、FOS及RIF等临床常用抗菌药物对上述4株MDRAB的联合抑菌指数（Fractional inhibitory concentration index,FICI）,以初步筛选基于COL和基于TGC具有协同效应的联合用药方案,并用于后续研究。（5）通过目标药物组合的药代动力学参数构建体外药代动力学/药效学（Pharmacokinetics/Pharmacodynamics,PK/PD）模型,模拟药物在人体药代动力学过程中对MDRAB的抗菌活性,治疗周期设定为48 h,初始细菌接种量预设为1x10^6 CFU/m L左右,绘制时间-杀菌曲线,并比较单药组、联合用药组的杀菌曲线下面积（The area under the bacterial killing curve,AUBC）和48 h菌落形成单位（Colony forming units,CFU）对数变化值(ΔLog10CFU0–48h),评价基于COL联合用药方案和基于TGC联合用药方案的协同效应,最后通过菌落谱型分析（Population analysis profile,PAP）明确基于COL的联合用药方案对实验菌株产生异质性耐药的影响。（6）通过尾静脉注射最低致死量（Minimum lethal dose,MLD）的AB767菌株,在ICR小鼠中构建急性致死性血流感染模型,设置感染对照组（Control,感染未治疗）、COL单药组（低剂量组COLL、高剂量组COLH）、TGC单药组（低剂量组TGCL、高剂量组TGCH）、其他单药组（棋盘法、体外PK/PD模型筛选出的药物）、COL低剂量联合组、COL高剂量联合组、TGC低剂量联合组、TGC高剂量联合组,每组10只小鼠,并于给药24 h后分析各组小鼠死亡率、主要器官（肝、脾、肺、肾）载菌量及各组存活小鼠血中载菌量,验证目标联合用药方案在体内的协同抗菌活性,并通过比较COL单药组和COL联合用药组血中分离菌株的异质性耐药率,在体内验证联合用药对异质性耐药的影响。结果:1.ICU患者感染CRKP的危险因素及预后分析:本研究共纳入138例患者,其中CRKP组97例,CSKP组41例。CRKP感染的独立危险因素包括同时存在≥3种基础疾病（OR=5.465,P=0.003）、既往住院史（OR=4.279,P=0.006）、喹诺酮类药物既往应用史（OR=5.872,P=0.012）及既往留置尿管（OR=5.035,P=0.000）。CRKP患者住院期间死亡率为42.1%,显著高于CSKP患者的17.5%（P=0.006）。2.临床分离MDRAB的联合用药策略研究:（1）4株MDRAB（AB034、AB239、AB536、AB767）来自不同的科室,除AB239来自尿液标本外,其余菌株均从痰液标本中分离,送检时间为2018、2019年。（2）AB034、AB239、AB536、AB767属于不同的ST分型,分别为ST368、ST191、ST195和ST540,并携带APH（3"）-Ⅰb、OXA-23、tet（B）等常见抗菌药物耐药基因和Ade B、Ade R、Ade G、Ade J等外排泵基因。（3）微量肉汤稀释法显示上述4株MDRAB对COL、SUL、MEM、FOS、CIP、LEV均耐药,MIC值为耐药折点的1-64倍,对RIF的MIC值均为2μg/m L（无耐药折点）;仅AB034和AB767对TGC敏感,AB536对AMI敏感;然而,AB034、AB239、AB767三株菌对AMI表现为高度耐药,MIC值均（29）8192μg/m L（128倍耐药折点）,故后续实验不再纳入AMI。（4）棋盘法表明,在基于COL的用药组合中,COL分别与MEM、FOS的协同效果最强,对4株MDRAB的FICI均≤0.5;在基于TGC的用药组合中,TGC联合MEM的协同效果最强,FICI均≤0.5;因此,将COL+MEM、COL+FOS、TGC+MEM作为初步的联合用药方案。（5）在体外PK/PD模型中,时间-杀菌曲线显示,尽管4株MDRAB（AB034、AB239、AB536、AB767）均对多黏菌素耐药,但COL+MEM、COL+FOS联合用药方案都具有较好的协同杀菌活性,AUBC、ΔLog10CFU0–48h相较于COL、MEM、FOS单药组,均显著降低。PAP结果显示,COL单用时实验菌株对COL异质性耐药高达64μg/m L,且随着COL剂量增加,高水平异质性耐药亚群比例随之增加,COL+MEM或FOS可显著抑制异质性耐药的产生。对于TGC+MEM联合用药方案,时间-杀菌曲线显示,其对TGC耐药菌株（AB239、AB536）几乎无效,仅对TGC敏感菌株（AB034、AB767）具有较好的协同效果,AUBC、ΔLog10CFU0–48h相较于单药组显著降低,可将CFU维持在相对较低的水平,但是该协同效果依赖于高剂量的TGC联合MEM,低剂量的TGC联合MEM协同效应并不显著,ΔLog10CFU0–48h与单药组相似。（6）AB767菌株所致血流感染对ICR小鼠的24 h MLD为1x10^10 CFU/m L（0.1 m L/10 g）。尾静脉注射MLD后,小鼠死亡率为100%,主要器官（肝、脾、肺、肾）载菌量均高达10^8CFU/m L,HE染色表明上述器官均有不同程度的坏死,组织破坏严重,提示急性致命性血流感染模型构建成功。在COL+MEM联合用药方案中,与Control组相比,各组死亡率均降低至20-30%,并且主要器官载菌量也显著降低,差异具有统计学意义（P（27）0.05）。与单药组相比,尽管COLH+MEM组可显著降低肝、肺、肾、血中载菌量（P（27）0.05）,但脾中载菌量和死亡率无明显差异。此外,联合用药组异质性耐药率也有所降低。在COL+FOS联合用药方案中,FOS组死亡率为70%,其余各组死亡率下降较为明显,仅为10-30%。和Control组相比,各组主要器官载菌量均有下降（P大多（27）0.05）。与单药组相比,COLH+FOS组主要器官肝、脾、肺、肾中载菌量显著降低（P（27）0.05）。尽管COLH联合FOS时,可将血中载菌量控制在较低水平,但和COLH组相比并无显著差异。此外,联合用药组异质性耐药率也比COL单药组低。在TGC+MEM联合用药方案中,TGCL组死亡率高达70%,TGCH组、MEM组、TGCL+MEM组死亡率为20-30%,TGCH+MEM组可将死亡率降为0%。此外,TGCH+MEM组相较于单药组,各主要器官（肝、肺、肾）和血中载菌量显著降低（P（27）0.05）,仅脾中载菌量无显著差异。结论:1.早期识别CRKP感染的高危患者并加以干预,如尽可能地减少住院史,合理使用喹诺酮类药物,降低侵入性有创操作的频次等,将有助于预防CRKP感染、改善患者预后。2.4株MDRAB（AB034、AB239、AB536、AB767）属于不同的ST分型,携带各种耐药基因和外排泵,对COL、SUL、MEM、FOS、CIP、LEV等多种临床常见抗生素耐药,仅AB034和AB767对TGC敏感,AB536对AMI敏感。3.基于COL的联合用药策略研究发现,尽管本实验中的4株MDRAB均对COL耐药,但COL联合MEM或FOS在体内外实验中仍表现出较强的协同抗菌活性,并显著降低实验菌株发生COL高水平异质性耐药的风险,提示即使AB菌株表现为COL耐药,基于COL分别联合MEM或FOS的用药策略依然可行。4.基于TGC的联合用药策略研究发现,TGC仅与MEM有较好的协同效应,即使用于血流感染,也可显著抑制TGC敏感菌株的生长。然而,该协同效果依赖于TGC的高剂量应用,并对于TGC耐药菌株几乎无抗菌活性。上述结果提示,对于TGC敏感MDRAB所致血流感染,高剂量的TGC联合MEM不失为一种有效的抗感染治疗方案。