背景早发性卵巢功能不全（Premature ovarian insufficiency,POI）是较常见的生殖内分泌疾病,在育龄期女性中,发病率约为1%-2%,临床表现为月经异常（闭经、月经稀发）、促性腺激素水平（Gonadotrophin,Gn）升高和雌激素（Ertradiol,E2）水平波动性下降,POI患者在40岁以前发病。有学者认为,POI的发生发展在临床上分为三个阶段,即隐匿期、生化异常期和显性（以前称为卵巢早衰）阶段。生化异常期早发性卵巢功能不全（Biochemical abnormal premature ovarian insufficiency,bPOI）患者通常月经规律,但是卵泡刺激素水平升高,生育能力下降。POI的病因有多种,包括遗传、机体免疫、代谢因素、感染性和医源性等多个方面。然而,大多数病例的发病机制仍不清楚,有待深入研究。颗粒细胞（Granular cell,GC）位于卵母细胞的周围,它与哺乳动物卵母细胞发育密切相关,并且与多种卵巢疾病相关,包括多囊卵巢综合征、早发性卵巢功能不全,卵巢过度刺激综合征以及卵巢颗粒细胞肿瘤等。颗粒细胞遗传信息的改变在疾病的发展过程中发挥重要作用。最近的证据表明,一些长链非编码RNAs（Long-noncoding RNA,Lnc-RNA）也会影响女性生殖系统疾病。测序技术的发展使得人们对基因组和转录组有着更深的理解。基因组和转录组分析表明,超过85%的人类基因组是由RNA转录而来的。转录翻译产生蛋白质的数量与转录本的总体数量相比是非常低的。因此,多数RNA的转录本是非编码RNA,它们在生物过程中发挥着十分重要且多样化的作用。Lnc-RNA的长度大于200个核苷酸,在过去的几十年里,由于缺乏编码蛋白质的能力,非编码RNA被称为“转录噪音”。然而,最近许多Lnc-RNA相关的研究已经证明,Lnc-RNA有多种功能并能够通过多种调节机制发挥作用,包括诱饵、增强器RNA、支架、介导、microRNA和短肽等。根据基因中或与相邻编码蛋白基因的位置对Lnc-RNA进行分类,如反义RNA和长链基因间非编码RNA（lincRNAs）。另一方面,基于Lnc-RNA的特征进行分类,将它们分为以下几类如Lnc-RNA激活基因、假性基因、端粒相关的非编码RNA、转录的超保留区、增强器RNA和环状RNA。最新研究表明,一些Lnc-RNA影响了卵巢GC的功能,从而影响人类卵母细胞成熟、受精、胚胎发育、肿瘤发生和卵巢功能衰竭等。GC中特异性的Lnc-RNA可被视为各种卵巢疾病的诊断或预后标志物。长链非编码核富集转录本（Nuclear paraspeckle assembly transcript,NEAT）是一种富集在胞核中的转录本,在哺乳动物中广泛存在,能够与核内的蛋白质结合而发挥重要作用。Lnc-NEAT家族中有著名的Lnc-RNA-NEAT1和Lnc-RNA-NEAT2也称为肺腺癌转移相关转录本 1（Metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1）,它们在多种组织和细胞中表达丰富并发挥重要作用,一旦它们的功能和表达紊乱将会对细胞和组织产生重大的影响。Lnc-MALAT1在卵巢颗粒细胞中表达水平较高。生殖领域,研究报道Lnc-MALAT1的异常表达与妊娠丢失,子宫内膜异位症和多囊卵巢综合征（Polycystic ovarian syndrome,PCOS）有关。在多囊卵巢综合征和内异症患者中,Lnc-MALAT1能够促进卵巢颗粒细胞增殖,抑制凋亡。与Lnc-MALAT1同一家族的Lnc-NEAT1也参与体内多种生理和病理过程,如免疫反应、病毒感染,肿瘤形成和神经退行性疾病等。DNA损伤修复通路受损可能会导致POI的发生。DNA损伤主要发生于DNA单链或双链断裂时,正常情况下细胞可以对这两种不同的DNA损伤发生应答,能够通过“细胞周期阻滞”这一过程暂时停止细胞分裂,随后启动DNA损伤修复,修复受损的遗传信息,使遗传信息在细胞生长和传代过程得以保真。其中,DNA双链断裂（Double strand breaks,DSB）是最为重要的DNA损伤。DNA损伤修复有两种重要的机制,一种发生在减数分裂同源重组过程中,为同源重组途径;另一种为非同源末端连接（Non-homologous end joining,NHEJ）。NHEJ途径高效修复是一个严谨的过程,需要多种蛋白质参与,包括DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-PKcs）、Ku70/80异源二聚体、DNA连接酶Ⅳ、X射线修复交叉补充 4（X-ray cross-complementing gene 4,XRCC4）和NHEJ1。NHEJ中,DSB首先被Ku70-Ku80二聚体（Ku）识别,二聚体可以作为一个装载蛋白,将其他的NHEJ相关蛋白招募到附近从而促进DNA末端连接。DNA依赖性蛋白激酶催化亚基（DNA-dependent protein kinase catalytic subunit,DNA-PKcs）能与Ku共同形成DNA-PK复合物,DNA-PKcs对Ku二聚体的末端有着高亲和力。X射线交叉互补基因（X-ray cross-complementing gene,XRCC）是在保护哺乳动物细胞免受电离辐射损害中的作用而被发现,与DNA损伤修复和遗传稳定性等功能密切相关。虽然这些基因的缺失不一定会造成对辐射的高度敏感性,但它们是各种DNA修复途径的重要组成部分。XRCC4定位在人第5号染色体,它的同源突变可能会引起原始侏儒症综合征,包括严重的身材矮小、小头畸形、原发性性腺功能衰竭、早发性代谢综合征和肿瘤易感性等。H2A的突变体γH2AX,参与组成核糖体组蛋白,能够被磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K）通路中的共济失调突变（Ataxia telangiectasia mutated,ATM）激酶和 ATM-Rad3相关激酶磷酸化。γH2AX是DNA损伤修复标志物的一种,它在DNA损伤修复中起着十分重要的作用,能够募集和定位大量修复因子参与NHEJ通路的修复。本研究通过探究原代POI颗粒细胞Lnc-MALAT1和Lnc-NEAT1的表达,并通过化疗药建立人卵巢POI细胞模型,探究Lnc-MALAT1和Lnc-NEAT1在POI发生发展中的作用以及与XRCC家族部分成员的关系,为寻找POI的发病机制提供新思路。目的本研究目的是明确Lnc-MALAT1和Lnc-NEAT1在卵巢颗粒细胞中的表达情况及在颗粒细胞DNA损伤修复、增殖和凋亡过程中的作用;阐明Lnc-RNA-MALAT1及Lnc-NEAT1与XRCC家族成员的调控关系。方法1)使用密度梯度离心法从早发性卵巢功能不全患者卵泡液中提取颗粒细胞。将提取出的颗粒细胞,于六孔板培养1-2天后收集,随后提取总RNA。2)利用RT-PCR技术检测POI患者颗粒细胞中Lnc-MALAT1、Lnc-NEAT1、XRCC4、XRCC5、XRCC6 的表达。3)分别使用1、10和100 μM喜树碱处理卵巢颗粒细胞（human granulosa cell,KGN）系2h、4h构建颗粒细胞POI模型。探究最佳的建立POI细胞模型的化疗药浓度和处理时间。4)使用反义核苷酸敲低KGN细胞系中Lnc-MALAT1的表达,同时使用喜树碱造成DNA损伤后,探究DNA损伤修复标志物γH2AX的表达和定位。5)敲低Lnc-MALAT1后检测细胞增殖和凋亡的变化。6)使用PCR和Western blot技术检测敲低Lnc-MALAT1后XRCC4的表达。结果1)分离出bPOI患者的原代颗粒细胞后,于六孔板中培养1-2天,细胞呈梭形,提取出RNA后进行RT-PCR,结果显示:Lnc-MALAT1和XRCC4在POI患者原代颗粒细胞中的表达下降。而Lnc-NEAT1、XRCC5和XRCC6的表达无显著差异。2)使用10 μM喜树碱处理卵巢颗粒细胞系（Human granulosa cell line,KGN）2h、4h构建POI细胞模型,通过免疫印迹技术（Western blot）发现喜树碱损伤KGN细胞系2h和4h后DNA损伤修复标志物γH2AX相似。最终,选择喜树碱损伤2h构建POI细胞模型。3)将KGN细胞系中Lnc-MALAT1敲低后,使用10μM喜树碱2h造成DNA损伤后,免疫荧光显示DNA损伤修复标志物γH2AX主要位于细胞核内。免疫荧光和Western blot均显示DNA损伤后修复4h和修复6h,Lnc-MALAT1敲低组γH2AX的表达显著高于对照组。4)将KGN细胞系中Lnc-MALAT1敲低后,发现细胞增殖显著减慢,晚期细胞凋亡显著上调。5)PCR和Western blot结果显示将KGN细胞系中Lnc-MALAT1敲低后,发现XRCC4的表达显著下调。结论1.Lnc-MALAT1和XRCC4在生化异常期POI患者卵巢颗粒细胞中表达降低。而Lnc-NEAT1、XRCC5和XRCC6在生化异常期POI患者卵巢颗粒细胞中表达无显著差异。2.抑制Lnc-MALAT1的表达可能通过下调XRCC4参与DNA损伤修复、抑制颗粒细胞增殖、促进凋亡。