糖基化修饰是蛋白质最重要的翻译后修饰之一,对蛋白质的正确折叠和稳定性、胞内运输及发挥生物学功能等有重要意义。杆状病毒的囊膜糖蛋白F在病毒感染细胞的过程中发挥重要作用,包括:介导病毒与宿主细胞吸附和入侵,指导病毒有效包装和释放等关键性步骤。棉铃虫病毒(Helicoverpa armigeranucleopolyhcdrovirus,HcarNPV)的F蛋白(HaF)是杆状病毒F蛋白中研究得最为透彻的代表。HaF蛋白分子大小约为80 kDa,它首先被翻译为前体蛋白F0,运输至反式高尔基体时被Furin蛋白酶剪切成为由二硫键链接的F1和F2两个片段。HaF蛋白具有丰富的N-糖基化修饰,然而对于具体的糖基化位点及其功能缺乏研究。本论文以HaF蛋白为研究对象,系统地研究了N-糖基化修饰及其功能,包括:(1)构建一系列单点和多点组合突变的重组HearNPV,通过Westernblot和质谱技术鉴定了HaF的N-糖基化修饰的精确位点:(2)通过对上述糖基化位点突变的重组病毒进行研究,揭示了N-糖基化修饰对蛋白定位、膜融合活性及病毒感染力等的影响,并通过生物信息学分析预测了各个糖基化位点在蛋白中所处的位置及可能的功能;(3)利用囊膜糖蛋白gp64缺失的苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(Autographa carlifrnica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)的假病毒系统对HaF在Sf9细胞中的糖基化修饰的情况及其生物学功能进行了研究。　　 第一章:文献综述。首先介绍了糖基化修饰的种类、N-糖基化修饰的过程以及研究进展;然后介绍了病毒糖蛋白在感染过程中的重要作用;随后简单介绍了杆状病毒主要囊膜糖蛋白GP64和F蛋白的功能以及糖基化修饰的研究现状;最后阐述了本论文的研究目的和意义。　　 第二章:在生物信息学分析的基础上,对HaF中预测的N-糖基化位点进行单点突变,并对关键位点进行了组合突变,构建成一系列重组HearNPV。所有单点突变的重组病毒都获得了有感染性的子代病毒,说明单个糖基化位点对于病毒感染不是必需的。通过Western blot和质谱技术鉴定了HaF蛋白确切的糖基化修饰位点。实验结果表明HaF蛋白有5个被利用的N-糖基化修饰位点,分别是N104、N293、N361、N526和N571。Western blot结果发现,当多个糖基化修饰位点同时突变时,HaF在细胞中的剪切效率显著下降,并且包装到病毒粒子中的F蛋白含量减少。当所有5个糖基化位点同时突变时,无法产生有感染性子代病毒粒子。为了研究N-糖基化位点的突变是否能被代偿,在N361或N104突变的同时,在附近区域分别引入了2个新的糖基化修饰位点N359和N102。Weaernblot检测发现N359在HaF的生物合成过程中可以完全补偿N361位点的突变,提示该位点可能具有重要的功能:而N102被糖基化修饰的效率远低于原有的N104位点,仅检测到少量被修饰的条带,但仍可产生有感染性的重组病毒。　　 第三章:对HaF的N-糖基化修饰的功能进行了系统研究。首先通过一步生长曲线和Q-PCR测定了单个糖基化位点突变的重组病毒的感染性病毒粒子产量和病毒感染力,发现N526位点突变时病毒粒子产量显著下降,病毒感染力降低。低pH诱导的膜融合实验表明除N526位点突变降低了HaF蛋白的融合活性外,其他糖基化位点的突变增强了HaF的融合活性。因此,N526是HaF蛋白中非常关键的糖基化修饰位点。尽管多个糖基化位点同时突变导致HaF蛋白大量滞留在胞内,但却仍然表现出增强的膜融合能力;另一方面,新引入的糖基化位点N359也导致HaF膜融合能力降低。这些结果说明糖链阻碍了HaF的膜融合活性。我们还对重组病毒入侵宿主细胞的相对效率进行了分析。此外,还利用脉冲追踪标记技术和免疫沉淀的方法对HaF蛋白的折叠情况进行了分析,揭示了关键的糖基化位点N526的突变导致HaF的折叠效率下降。最后,利用生物信息学手段预测了HaF融合前、后的三维结构,并推测了N-糖基化位点在HaF融合前后的空间位移情况及对膜融合能力的影响。　　 第四章:利用gp64-null AcMNPV的假病毒系统研究了HaF蛋白在Sf9细胞中的糖基化修饰的状况和功能。通过转染和感染实验表明单个糖基化位点突变的HaF均能替代GP64产生感染性的假型AcMNPV,但多个位点突变无法产生有感染性的假型病毒。对重组假型病毒进行一步生长曲线和Q-PCR测定发现,N526仍然是HaF替代GP64时的关键糖基化修饰位点。用Western blot对重组病毒及感染的Sf9细胞样品进行分析发现,与HaF在其宿主HzAM1细胞的情况相似,N104、N293、N361、N526和N571这5个位点在Sf9细胞也被糖基化修饰。而在HzAM1细胞中不被利用的N595位点在Sf9细胞中是否被利用还与需要通过质谱分析等手段进一步验证;此外F2片段中的N104突变影响了F1片段的修饰,FN361s突变型影响了F2片段的糖基化修饰。这些结果说明Sf9和HzAM1细胞系统对HaF蛋白的糖基化修饰的调控存在一定的差异。　　 第五章:对蛋白糖基化修饰研究的前景展望。在前几章鉴定了HaF蛋白糖基化修饰位点及其功能的基础上,从宿主分子伴侣Calnexin/Calreticulin与寡糖链的相互作用及其对HaF的折叠和成熟的影响、昆虫细胞糖基化修饰系统的改造以及通过操控糖蛋白的折叠与构象提高蛋白的免疫原性等三个方面进行了展望。对于深入揭示糖基化修饰的调控机制、改良昆虫细胞的糖基化修饰状况具有指导意义。