论文部分内容阅读
目的探讨长链非编码RNA(Long non-coding RNA,Lnc RNA)SNHG3对急性肺损伤(Acute Lung Injury,ALI)肺微血管内皮屏障通透性的影响及调节机制,明确SNHG3是否通过靶向miR-186-5p,调节wnt信号通路活性,从而调节肺微血管内皮屏障通透性。方法1.体外培养原代人肺微血管内皮细胞(HPMVEC),分别采用浓度0ng/ml,50ng/ml,100ng/ml,200ng/ml的肿瘤坏死因子(TNF-α)干预HPMVEC 24h后,进行细胞功能试验:细胞增殖活性检测(CCK-8),并采用q RT-PCR及Western Blot检测紧密连接蛋白claudin-5、ZO-1的表达情况。2.qRT-PCR检测不同浓度TNF-α干预下SNHG3的表达情况。转染si RNA-SNHG3至HPMVEC中,荧光显微镜观察转染效果,q RT-PCR检测SNHG3的表达情况。TNF-α处理转染后HPMVEC 24h后,采用CCK-8检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,transwell小室检测屏障FITC-葡聚糖通透率,q RT-PCR检测claudin-5、ZO-1的表达。3.Star Base数据库预测SNHG3与miR-186-5p的结合位点,双荧光素酶报告基因实验验证靶点关系。q RT-PCR分别检测梯度浓度的TNF-α干预后及转染si RNA-SNHG3后miR-186-5p的表达,皮尔逊相关分析观察SNHG3与miR-186-5p的相关关系。转染miR-186-5p inhibitor至HPMVEC中,q RT-PCR检测miR-186-5p的表达情况。TNF-α处理转染后HPMVEC 24h后,采用CCK-8及流式细胞术分别检测转染后细胞的存活率及凋亡率,transwell小室检测屏障FITC-葡聚糖通透率,Western Blot检测claudin-5、ZO-1的表达。4.通过Star Base数据库预测miR-186-5p与wnt5a的靶点关系,双荧光素酶报告基因实验验证靶点关系。q RT-PCR分别检测梯度浓度的TNF-α干预后及转染miR-186-5p inhibitor后wnt5a的表达,皮尔逊相关分析观察miR-186-5p与wnt5a的相关关系。HPMVEC共同转染si RNA-SNHG3、miR-186-5p inhibitor,同时应用wnt通路激活剂Licl,TNF-α处理转染后HPMVEC 24h后,q RT-PCR检测miR-186-5p及wnt5a的表达情况,采用CCK-8检测细胞存活率,流式细胞术检测细胞凋亡率,transwell小室检测屏障FITC-葡聚糖通透率,Western Blot检测claudin-5、ZO-1的表达。结果1.梯度浓度TNF-α干预HPMVEC后,细胞存活率降低,q RT-PCR及Western Blot结果显示claudin-5、ZO-1的表达减少,均呈梯度依赖性(均P<0.05)。2.q RT-PCR结果显示SNHG3的表达随TNF-α浓度增加而增加。分别转染si RNA-SNHG3至HPMVEC后,荧光照片及q RT-PCR结果均显示转染si RNA-3效果优于si RNA-1、2,故筛选得到si RNA-3下调SNHG3的表达水平最显著。下调SNHG3的表达并采用TNF-α干预后,HPMVEC存活率增加,凋亡率减少,FITC-葡聚糖通透率减少,claudin-5、ZO-1的表达增加(均P<0.05)。3.Star Base数据库预测到SNHG3可与miR-186-5p相结合,双荧光素酶报告基因实验结果显示SNHG3与miR-186-5p之间存在靶点关系。q RT-PCR结果显示梯度浓度0ng/ml,50ng/ml,100ng/ml,200ng/ml的TNF-α干预下miR-186-5p的表达随浓度增加而降低,转染si RNA-SNHG3后miR-186-5p的表达增加,相关性分析结果显示SNHG3与miR-186-5p呈负相关关系。转染miR-186-5p inhibitor后,荧光显微镜观察筛选出最佳转染比例,q RT-PCR结果显示转染miR-186-5p inhibitor后miR-186-5p的表达显著降低;TNF-α干预转染miR-186-5p inhibitor的HPMVEC后,CCK-8结果显示细胞存活率降低,凋亡率增加,FITC-葡聚糖的通透率增多,claudin-5、ZO-1的表达减少(均P<0.05)。4.Star Base数据库预测到miR-186-5p可与wnt5a相结合,双荧光素酶报告基因实验结果显示miR-186-5p可与wnt5a之间存在靶点关系。q RT-PCR结果显示梯度浓度0ng/ml,50ng/ml,100ng/ml,200ng/ml的TNF-α干预下wnt5a的表达随浓度增加而增加,转染miR-186-5p inhibitor后wnt5a的表达增加,相关性分析结果显示miR-186-5p与miR-186-5p呈负相关关系。共同转染si RNA-SNHG3、miR-186-5p inhibitor并应用Licl后,结果显示:与si RNA-SNHG3组相比,si RNA-SNHG3+miR-186-5p inhibitor及si RNA-SNHG3+Licl组miR-186-5p的表达均降低,wnt5a的表达均增加,细胞存活率降低,凋亡率增加,FITC-葡聚糖通透率增多,claudin-5、ZO-1的表达减少;此外,共同转染si RNA-SNHG3、miR-186-5p inhibitor并应用Licl可逆转下调SNHG3的表达对HPMVEC存活率、凋亡率、微血管内皮屏障FITC-葡聚糖通透率及claudin-5、ZO-1的表达的作用(均P<0.05)。结论1.SNHG3可通过调节人肺微血管内皮屏障紧密连接蛋白claudin-5、ZO-1的表达从而参与调节肺微血管内皮屏障的通透性。2.miR-186-5p可通过靶向结合并负向调节wnt5a的表达,从而调节claudin-5、ZO-1的表达,参与调节肺微血管内皮屏障的通透性。3.SNHG3可通过miR-186-5p/wnt轴发挥对肺微血管内皮屏障通透性的调节作用。