研究背景心脑血管疾病是当今社会危害人类(特别是50岁以上中老年人)健康和生命的最主要疾病,主要包括高血压、冠状动脉粥样硬化性心脏病(简称冠心病)、脑卒中等。由于心血管疾病具有高发病率、高致残率、高病死率、高复发率、多并发症的特点,近些年来,心血管疾病的发病率和病死率均有上升趋势。国内外的研究发现,许多心血管疾病与氧自由基引起的氧化应激密切相关。人体内的自由基(free Radical,FR)来源于两方面。一是外源性FR,主要是由于大气污染物质,电离辐射,酒精、高压氧中毒、某些药物等引起。二是内源性FR,包括：①机体正常代谢过程中产生；②在机体发生炎症时产生;③金属离子作为氧化还原反应中的催化剂时产生；④组织缺血低氧时产生。自由基的种类很多,以氧自由基(oxygen derived free radicals,OFR)为主,包括超氧阴离子(O-2)、羟自由基(·OH)、有机过氧基(ROO-)、过氧化氢(H-2)、氮氧自由基(NO·)等,统称为活性氧(reactive oxygen species,ROS)。生成ROS的前氧化系统主要有线粒体、细胞色素p450、铁及其他金属离子、中性粒细胞和巨噬细胞等。生成ROS的抗氧化防御系统主要有：①一级抗氧化防御系统包括过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽系统、其他抗氧化系统等；②二级抗氧化防御系统包括DNA修复、蛋白修复与降解、解毒系统、膜修复、再生系统等。体内ROS产生过多或者清除减少,造成体内前氧化系统与抗氧化防御系统之间的平衡紊乱即为氧化应激(oxidation stress)。机体内抗氧化系统：①抗氧化酶类系统,包括超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、过氧化氢酶(CAT)等,是人体对抗FR的第一道防线；②非酶类抗氧化剂,包括维生素C(VitC)、维生素E(VitE)、褪黑素(MLT)、谷胱甘肽(GSH)等。它们可清除FR,抑制FR对组织细胞的损伤,保护细胞及机体的正常生理功能。抗氧化剂有如下的共同作用特点(1)能有效地清除O2-,H2O2,O2等活性氧；(2)能够清除O2-OH ROO(脂质自由基)等自由基；(3)能清除脂质过氧化物,减轻ROS对组织细胞的过氧化损伤,降低脂质过氧化形成；(4)阻止LDL被氧化形成氧化型LDL；(5)有效降低人体内过氧化脂质MDA的含量,并提高两种主要的抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性。VitC是水溶性抗氧化剂,存在于细胞内外液,是细胞外液的主要抗氧化剂。人类血浆遭受各种氧化损伤时,它构成第一道抗氧化防线,能有效地清除O2-、H2O2、O2等活性氧。Yallampalli等[3]发现VitC能抑制动脉内皮细胞产生脂质过氧化物,发挥延缓细胞凋亡和抗氧化作用。部分研究显示VitC能减少主要冠脉事件,扩张型心肌病患者给予大剂量VitC治疗,病人病情缓解稳定持续时间延长,心律失常减少。接受尿激酶溶栓治疗的急性心肌梗死患者给予VitC10g治疗可明显减低心肌酶峰值水平,减少缺血再罐注对心肌的损伤。王光辉对108例高血压患者分为治疗组和对照组各54例,对照组采用常规药物治疗,治疗组在此基础上加服大剂量VitC,结果治疗组随访疗效明显好于常规药物治疗的对照组,患者血压基本都能够稳定在120/80mmHg,患者的各种高血压症状均消失,提示大剂量VitC有助于降低高血压。VitE又称生育酚,是存在于细胞内的较强的小分子抗氧化剂,能够清除O2-, OH, ROO(脂质自由基)等自由基。VitE可升高内皮型一氧化氮合酶表达、降低诱生型一氧化氮合酶表达。急性心肌梗死患者同时给予VitC(1200mg/d×30d)和VitE (1000mg/d×30d),可发现患者的心血管事件发生率明显降低。健康受试者给予VitE100mg/d,可降低LDL胆固醇、血小板平均体积、血小板聚集,这一作用可能与减少血栓事件发生有关。p-胡萝卜素是VitA的前体,脂溶性抗氧化剂,是很有效的单电子键氧化抑制剂,也能抑制脂质过氧化。氧化型LDL会损伤血管上皮细胞,加速脂质沉积形成斑块,阻塞血管,引发阻塞性动脉粥样硬化等疾病,而8-胡萝卜素可阻止LDL被氧化形成氧化型LDL。给冠心病患者每隔一日口服50mg β-胡萝卜素胶囊,其发病次数减少了50%。另外,β-胡萝卜素可使慢性心绞痛病人冠状动脉病死亡风险减少44%。血浆中p-胡萝卜素的浓度升高与血压降低有关联[9],经p-胡萝卜素预处理的心肌细胞进行缺氧处理发现细胞内保持有抗氧化机制,因此p-胡萝卜素的适度补充可减少心血管疾病的发生。辅酶Q10是一种脂溶性抗氧化剂,是细胞线粒体中的能量转换剂,可以保护哺乳动物细胞免于线粒体氧化应激引发的凋亡,有明显的抗脂质过氧化的作用,能有效降低人体内MDA的含量,并提高SOD和GSH-Px的活性。高血压患者在使用降压药的同时给予辅酶Q10,不仅能够缓解降血压药所引起的高血压患者心脏中缺乏辅酶Q10,增强降压效果,而且还可预防药物的副作用。心肌缺血患者在常规药物治疗基础上给予辅酶Q10,可明显减少患者心绞痛发作次数。总之,在心血管病中,辅酶Q10可改善心肌能量产生,有抗氧化活性和使生物膜稳定的特性,另一个优点是安全无毒无副作用。MLT通过清除自由基,抗氧化和抑制脂质的过氧化反应保护细胞结构,防止DNA损伤、降低体内过氧化物的含量。在细胞膜、胞质和细胞核中均发挥强大的抗氧化作用。MLT及其代谢产物都是有效的自由基清除剂。Brugger等发现冠心病患者夜间MLT的浓度明显低于正常人,若给予其口服MLT,可减少夜间冠心病病变的发生率。MLT与原发性高血压关系密切,临床上也发现随着昼夜节律的变化,MLT与血压之间出现一定的浓度一时间关系,早上6～9时MLT水平最低,而此时血压最高,极易出现高血压危象。原发性高血压患者给予MLT治疗1个月后,其血压都有不同程度的下降。GSH的结构中含有一个活泼的巯基-SH,易被氧化脱氢,这一特异结构使其成为体内主要的自由基清除剂。GSH对急性心肌梗死患者再灌注后具有明显的抗氧化应激作用,可以减轻氧化应激损伤,保护心肌细胞,解除心肌顿抑,缩小扩大的心室,抑制左心室重构,进而改善心功能,在常规治疗的同时添加GSH是治疗急性心肌梗死的有效治疗方法之一。GSH通过巯基与体内的自由基结合,加速自由基的排泄。舒血宁和还原型谷胱甘肽联合治疗慢性心功能不全时,能有效地清除体内自由基,改善血液动力学,扩张冠脉血管,降低血液黏度,减少微血栓形成,从而加快慢性心功能不全患者的康复,提高这类病人的治疗效果,缩短治疗时间,明显改善病人的生活质量。生理PH时,SOD可以使02-的歧化速度提高104,是机体清除自由基的一种极其重要的方式,ROS参与了心血管疾病发生、发展的整个过程,SOD能清除脂质过氧化物,可减轻ROS对组织细胞的过氧化损伤,降低脂质过氧化形成,从而保护血管内皮免受氧自由基的损伤,防止动脉硬化的形成。开心外科手术中利用rh-SOD来防止再灌流的损伤。a-硫辛酸(alpha lipoic acid,ALA)是存在于线粒体内的辅酶,具有脂溶和水溶双重特性,是一种理想的生物抗氧化剂。可以清除FR和ROS,螯合金属离子,再生谷胱甘肽、维生素C、维生素E等抗氧化剂。临床上ALA因副作用少而被广泛应用于治疗糖尿病周围神经病变、AIDS等。近年来的一些研究表明ALA对多种途径引起的内皮细胞的氧化应激也有保护作用,因此如果能明确ALA的作用并深入阐明其分子作用机理,ALA可能是一个非常有临床应用前景的心血管疾病的治疗药物。第一部分α-硫辛酸对氧化应激下HUVEC损伤的保护作用目的建立HUVEC缺氧/复氧模型,摸索ALA用于HUVEC的最佳浓度,观察ALA对缺氧/复氧诱导的HUVEC细胞的氧化损伤是否具有保护作用。方法1.HUVEC缺氧/复氧模型的建立细胞分别经缺氧2,4,8,12h,复氧2,4,6,12,18,24h处理,用MTT检测细胞活力。2.ALA浓度的选择HUVEC分别给予不同浓度的ALA (0.25,0.50,1.00mM/L)前处理与后处理,用MTT检测细胞活力。3.ALA前处理与后处理对缺氧/复氧诱导的HUVEC细胞的氧化损伤的保护作用按照试剂盒说明书分别检测每组细胞培养上清液中的LDH、GSH含量与培养细胞中的TAOC、SOD、MDA水平。结果1. HUVEC给予不同时间(2,4,8,12h)的缺氧,用MTT检测细胞活力后的结果表明,与对照组比较,各缺氧组的细胞活力明显下降,且呈时间依赖性。与对照组比较,缺氧2h的细胞活力为93.77%(P<0.05),缺氧4,8,12h的细胞活力分别77.67%,60.67%,45.33%(P<0.01)。当缺氧4h时,HUVEC给予不同时间(2,4,6,12,18,24h)复氧,与复氧Oh比较,复氧12h时,细胞活力下降至48.33%。然而,复氧18,24h后的细胞活力上升至52.67,60.67%。2.给予培养HUVEC不同浓度的ALA (0.25,0.5,1.0mmol/L)前处理与后处理,与模型组相比,ALA前处理与后处理剂量依赖性地提高细胞存活率。3.与对照组比较,HUVEC缺氧4h复氧12h后GS、SOD与TAOC含量明显下降,LDH、MDA含量明显升高。而ALA前处理与后处理能明显升高GSH、SOD与TAOC水平,降低LDH、MDA水平。结论1.我们选择缺氧4h复氧12h为本实验的模型组。2.ALA对于HUVEC的最佳使用浓度为1.0mmol/L。3.ALA可减少缺氧/复氧诱导的HUVEC细胞的氧化损伤。第二部分α-硫辛酸对氧化应激下HUVEC的保护作用-细胞凋亡机制目的探讨HUVEC细胞在氧化应激下是否发生凋亡及ALA对凋亡的干预作用。方法倒置相差显微镜下观察各组细胞形态,Annexin-VIPI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率,UNNEL试剂盒检测细胞凋亡,JC-1染色荧光显微镜下观察线粒体膜电位的变化及western blot检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的表达。结果在倒置相差显微镜下观察细胞形态,对照组HUVEC生长旺盛,呈上皮样贴壁生长,细胞呈多角形或长梭形铺满底层。缺氧/复氧组细胞间间隙增大,细胞收缩变圆,少数细胞悬浮脱落；而ALA处理组细胞形态与模型组比较细胞间隙变小,收缩变圆及悬浮脱落的细胞减少。Annexin-VIPI双染流式细胞仪检测细胞凋亡率,对照组细胞早期凋亡、晚期凋亡及坏死的很少；模型组细胞凋亡明显增加,以早期凋亡、晚期凋亡为主；而ALA前处理与后处理组细胞凋亡明显减少。TUNNEL试剂盒检测细胞凋亡,对照组细胞几乎无TUNNEL染色阳性细胞,模型组TUNNEL染色阳性细胞较多,而ALA前处理与后处理组的TUNNEL染色阳性细胞均较模型组减少。JC-1染色在荧光显微镜下观察,对照组细胞膜电位较高,JC-1形成聚合物(J-aggregates),产生红色荧光；而缺氧复氧处理后,大部分JC-1为单体(monomer),产生绿色荧光。1mmol/L ALA前处理与后处理后,红绿荧光的相对比例较模型组升高。Western blot检测凋亡相关蛋白cleaved caspase-3的表达,与对照组相比,模型组的cleaved caspase-3蛋白表达水平明显升高；而与模型组相比,ALA预处理与后处理组的cleaved caspase-3蛋白表达明显降低。结论ALA前处理与后处理可明显减少缺氧复氧所引起的细胞凋亡。第三部分α-硫辛酸对氧化应激下HUVEC的保护作用-细胞自噬机制目的探讨HUVEC细胞在氧化应激下是否发生自噬及ALA对自噬的干预作用。方法透射电镜及MDC染色观察各组自噬囊泡的形成,western blot检测自噬相关蛋白LC3B、beclin1蛋白的表达。结果透射电镜下观察发现,对照组HUVEC细胞呈近似圆形,细胞胞浆内各细胞器、细胞核、染色体形态与分布正常。模型组细胞胞浆成分形成大量双层及多层膜结构的自噬体,轮廓清晰可见,另有一些自噬泡的内容物为被消化降解的髓鞘样结构,线粒体肿胀明显。而ALA处理组细胞胞质中单层或双层膜包裹着的处于不同降解阶段的胞浆成分或废弃的细胞器经消化降解后形成的板层样结构的程度明显低于模型组,且线粒体肿胀程度减轻。通过MDC染色,我们发现,对照组的荧光染色较弱；模型组细胞内的绿色荧光明显增多；我们将细胞给予ALA前处理与后处理,染色后观察,这两组细胞内的荧光表达明显下降。Western blot检测自噬相关蛋白LC3B、beclinl蛋白的表达,缺氧复氧处理后,HUVEC内LC3-II/LC3-I的比值明显增加,提示部分LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ转化；ALA前处理与后处理后LC3-II/LC3-I的比值明显减少。对照组的beclinl水平较低,经缺氧处理后, beclinl水平显著提高,ALA前处理与后处理后beclinl水平相对于模型组减轻。结论ALA前处理与后处理可明显减少缺氧复氧所引起的细胞自噬。