RNA干扰是动植物体内核酸水平的一种古老的抗病毒方式。许多病毒可以编码蛋白质来对抗这一作用。丙型肝炎病毒常常引起慢性感染,并导致慢性丙型肝炎及肝癌。作为一种单链RNA病毒,丙型肝炎病毒可能受到宿主细胞的RNA干扰体系的攻击,亦有可能产生RNA干扰抑制因子来逃避宿主这一抗病毒反应。为验证这一推测,本研究分别建立了针对绿色荧光蛋白和虫荧光素酶基因的RNA干扰体系,用于RNA干扰抑制因子的筛选实验。利用已经建立的RNA干扰体系对丙型肝炎病毒的编码一些蛋白质进行了筛选,发现核心蛋白能够抑制shRNA引起的RNA干扰现象,其余蛋白质未发现类似作用。这种对抗作用在多种细胞系里得到验证,且呈剂量依赖关系。通过构建系列缺失突变体,发现核心蛋白N端氨基酸是拮抗RNA干扰所必需的。当用于siRNA介导的RNA干扰体系时,发现核心蛋白不能对抗siRNA介导的RNA干扰体系。提示核心蛋白是通过抑制siRNA的形成发挥抑制RNA干扰的作用。由于没有发现核心蛋白对细胞内Dicer表达水平存在明显降低影响,推测可能是通过结合Dicer并抑制了其活性。我们利用免疫共沉淀技术证实了核心蛋白能够结合细胞内Dicer,而重组表达的核心蛋白在体外实验中能够抑制Dicer对双链RNA的切割作用。因此本研究结论认为:丙型肝炎病毒核心蛋白能够对抗宿主细胞的RNAi机制,这种对抗作用是通过结合并抑制Dicer的活性实现的。核心蛋白的这种功能可能有利于提高丙型肝炎病毒生存能力并导致持续感染,亦可能在丙型肝炎病毒致病尤其是是致瘤中发挥重要作用。第一部分RNA干扰抑制因子筛选模型的建立第一节短发夹状RNA干扰内源性绿色荧光蛋白的表达目的建立稳定表达绿色荧光蛋白的细胞株,构建短发夹RNA(shRNA)表达质粒并观察其对内源性GFP的抑制作用,建立内源性绿色荧光蛋白为靶基因的RNA干扰体系。方法转染pEGFP-N1至HepG2细胞,利用G418筛选获得稳定表达GFP的细胞株(HepG2.GFP);设计合成针对GFP基因的siRNA对应的DNA片段,插入转录载体pTZU6+1,构建shRNA表达载体pshRNA-GFP,转染细胞HepG2.GFP,荧光显微镜观察细胞荧光强度,以western blot检测GFP蛋白水平,以RT-PCR检测GFP mRNA水平。结果筛选得到的细胞株HepG2.GFP能够稳定表达绿色荧光蛋白,利用PCR方法从细胞基因组DNA中检测到GFP基因;成功构建shRNA的表达质粒,该载体表达的pshRNA-GFP能够显著抑制细胞中内源性GFP的表达。结论GFP基因成功整合至HepG2细胞基因组中,pshRNA-GFP能够显著抑制内源性GFP的表达,效果直观可靠,该系统能够用于RNA干扰机制等研究中。第二节RNA干扰技术抑制虫荧光素酶基因的表达目的研究载体表达的短发夹状双链RNA(shRNA)及化学合成的siRNA对虫荧光素酶基因表达的特异性抑制作用,建立RNA干扰的定量分析系统。方法构建针对虫荧光素酶基因的shRNA表达载体(pshRNA-Luc)及虫荧光素酶和海肾荧光素酶双表达载体(pLuc-FR),化学合成针对虫荧光素酶基因的siRNA,将pshRNA-Luc及siRNA分别与pLuc-FR共转染hepG2细胞,于转染后48h收集细胞,利用双荧光素酶分析系统检测荧光素酶活性。结果成功构建了针对虫荧光素酶基因的shRNA表达载体,该载体表达的shRNA能够显著下调虫荧光素酶基因的表达。化学合成的siRNA显著降低了虫荧光素酶的表达,较低的使用浓度抑制率即可达70%左右。结论成功建立了针对虫荧光素酶基因的RNA干扰体系,可用于定量分析影响RNA干扰机制的因素。第三节番茄丛矮病毒P19蛋白抑制短发夹RNA介导的RNA干扰作用目的研究番茄丛矮病毒P19蛋白对RNA干扰的抑制作用,检验建立的两个RNA干扰模型对RNA干扰抑制因子的检出效果。方法利用建立的针对内源性GFP和外源性虫荧光素酶基因的RNA干扰模型,将P19真核表达质粒与shRNA表达质粒共转染细胞,利用荧光显微镜观察细胞绿色荧光表达情况,以western blot和RT-PCR检测GFP的表达水平,以双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性。结果与空载体对照组相比较,加入P19的实验组绿色荧光明显更强,western blot可见GFP表达增高,RT-PCR发现GFP mRNA表达水平恢复较高。在荧光素酶系统上,虫荧光素酶活性恢复到70～80%。结论P19在哺乳动物细胞内能够对抗shRNA介导的RNA干扰作用。实验中所建立的RNA干扰体系,能够用来进行广泛的RNA干扰抑制因子的筛选,为下一步研究其它RNA干扰抑制因子奠定了基础。第二部分丙型肝炎病毒核心蛋白抑制shRNA介导的RNA干扰作用目的研究丙型肝炎病毒编码的蛋白对RNA干扰的抑制作用,筛选出有作用的RNA干扰抑制因子,并对该因子的作用方式作进一步研究。方法利用已经建立的针对虫荧光素酶基因的RNA干扰体系,将HCV编码的蛋白质加入该体系中,观察RNAi效果是否受到影响,筛选出有作用的蛋白因子。在针对内源性EGFP的RNA干扰体系中进一步确证该种抑制作用。对该蛋白抑制RNAi干扰的剂量效应关系、在不同细胞系中的作用以及不同结构域的作用进行研究。观察该因子对siRNA介导的RNA干扰是否有相同的拮抗作用。结果筛选到丙型肝炎病毒核心蛋白能够恢复被shRNA抑制的虫荧光素酶基因和绿色荧光蛋白基因的表达,该种抑制作用在HepG2、HEK293和Hela细胞中均存在,且抑制作用呈剂量依赖关系。通过构建系列缺失突变体,发现核心蛋白N端氨基酸是对抗RNAi所必需的序列。核心蛋白不能恢复被siRNA沉默的虫荧光素酶活性。结论丙型肝炎病毒核心蛋白能够对抗shRNA介导的RNA干扰作用,但不能对抗siRNA介导的RNA干扰作用,这种作用具有普遍性。核心蛋白对抗RNA干扰的作用可能有利于提高丙型肝炎病毒在宿主细胞内的生存能力并导致持续感染,亦可能在丙型肝炎致病机制中发挥重要作用。第三部分丙型肝炎病毒核心蛋白抑制Dicer的功能实验目的研究核心蛋白与Dicer的相互结合作用及对其功能的影响。方法真核表达核心蛋白,利用免疫荧光染色和western blot检测核心蛋白在细胞内的表达。利用western blot检测核心蛋白对细胞内Dicer表达水平的影响,利用免疫共沉淀技术检测真核细胞内核心蛋白与Dicer的结合作用。体外转录合成双链RNA(dsRNA),体外抑制实验检测核心蛋白对Dicer切割dsRNA产生siRNA的功能的抑制作用。结果核心蛋白对细胞内Dicer表达水平无明显作用,免疫共沉淀实验发现核心蛋白在真核细胞内可以结合Dicer,而体外实验证实核心蛋白能够抑制Dicer对dsRNA的切割。结论核心蛋白在真核细胞内可以结合Dicer并抑制其功能,核心蛋白对RNA干扰的抑制作用是通过抑制Dicer切割dsRNA,阻止siRNA的形成过程实现的。