研究背景及意义黄韧带骨化症（OLF,ossification of ligamentum flavum）是黄韧带组织慢性骨化引起脊髓、神经根压迫的一种疾病,是引起椎管狭窄较为常见的原因[1,2]。据文献报道,其在中国人中发病率约为3.8%,且女性较多[3]。其起病隐匿,临床表现多变,容易误诊、漏诊,目前手术是治疗黄韧带骨化症的唯一手段[4]。黄韧带骨化症的发病机制不详,目前研究表明其与各种致病因素均有密切关系,包括遗传因素、韧带损伤、力学刺激、炎症等[5]。之前研究中,我们发现黄韧带组织中存在具有成骨分化能力的干细胞,因此探究黄韧带组织中干细胞的成骨分化过程能为疾病的机制探索与治疗预防提供重要的指导[6]。黄韧带位于连接两个相邻椎板的椎管后外侧,分为两部分:包膜部分和层间部分。正常情况下,它由弹性纤维和胶原纤维组成。在OLF患者身上,黄韧带组织表现为异位分化的骨组织,这提示着黄韧带骨化症的本质就是异位骨化[7]。之前的研究表明,黄韧带组织中存在着具有成骨、成脂、成软骨分化的干性细胞,这些细胞被定义为黄韧带干细胞（h LFSCs）,它们在黄韧带骨化过程中起着非常重要的作用[6,8,9]。因此,研究h LFSCs的成骨分化,对治疗OLF有潜在的指导意义。国内外研究表明,力学刺激、低氧微环境是诱发OLF的重要因素,但我们仍不清楚拉应力是否与h LFSCs的成骨分化有关系[10,11]。OLF与生物力学有直接关系,有文献报道,异常拉力导致OLF的发生率升高,而OLF也更容易发生在作为脊柱的应力中心的胸椎[12]。Vlaikoud等人证实了力学刺激确实可以调控部分细胞的生物学过程,其中包括正向调控干细胞的成骨分化过程[13]。有最近的文献表明,大鼠的胸椎黄韧带骨化模型,可以通过循环拉应力诱导实现[14],所以我们能猜想力学与h LFSCs的成骨分化有关,然而迄今为止,还没有人探究拉应力与h LFSCs的关系,以及拉应力在黄韧带骨化过程中的机制。Piezo1是一种于2010年新发现的机械力敏感离子通道蛋白,其主要功能是感知、传导和转换细胞膜上的机械信号,在调控细胞生理活动中起重要作用[15]。Piezo1稳定表达于各类细胞,包括骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchyml stem cells,BMSCs）、牙周干细胞、骨骼干细胞等[16,17],这些细胞通过Piezo1蛋白通道接受外界机械刺激,从而影响增殖、分化、迁移和凋亡的过程[18,19]。Piezo1通道是非神经元细胞接受机械力调控的主要途径。机械拉应力可以通过Piezo1通道促进BMSCs的成骨分化,并减弱其成脂分化[20]。机械拉应力可以通过Piezo1通道刺激人牙周干细胞的成骨分化[21]。这些研究证明,Piezo1通道蛋白在机械刺激促进干细胞成骨分化的过程中起着关键作用。基于以上内容,本课题通过对h LFSCs成骨分化、拉应力刺激、低氧微环境、Piezo1通道进行研究,分析了拉应力、低氧条件是否可以促进h LFSCs的成骨分化,拉力促进h LFSCs成骨分化的机制,Piezo1通道在其中所起的作用。这些结果为我们进一步明确OLF的发病机制有深远意义。研究方法1.h LFSCs细胞提取、鉴定。剪碎腰椎间盘突出症（lumbar disc herniation,LDH）患者术后的黄韧带标本,I型胶原酶消化6小时。消化液通过细胞筛网过滤得到细胞悬液,悬液转移至15ml离心管,后1500 r/min离心5min,弃上清后干细胞完全培养基重悬,转移至包被有凝血酶和Fibronectin的培养瓶中。3天后观察细胞贴壁情况。当细胞生长至融合率80%-90%,1:3传代。第3代h LFSCs用于实验研究。通过流式细胞仪鉴定细胞表面抗原,并通过成骨诱导培养基、成脂肪诱导培养基、成软骨诱导培养基,对h LFSCs进行诱导分化。2.通过CCK8实验筛选Co Cl2的最适浓度,WB实验观察Co Cl2和物理缺氧对h LFSCs的影响是否相同,并观察Co Cl2模拟的缺氧对h LFSCs细胞成骨分化能力的影响。通过Flexcell细胞拉力仪对h LFSCs施加拉应力,比较不同时间段下,h LFSCs的成骨分化情况。3.通过免疫荧光染色及WB验证Piezo1通道蛋白在h LFSCs上的表达情况。将h LFSCs接种至共聚焦皿上,待细胞贴壁后,PBS清洗细胞,而后免疫荧光固定液固定30min。后PBS清洗,再用免疫荧光封闭液封闭1h,Piezo1一抗孵育过夜。随后利用荧光标记的二抗孵育1h。DAPI染液复染5min。共聚焦显微镜观察Piezo1表达情况。4.通过Ca2+指示剂观察拉力、Yoda1对Piezo1通道的激活情况。将h LFSCs接种在共聚焦皿中,然后用含有5μM Cal-590 cell-permeant、0.02%Pluronic F-127和1m M丙磺舒的HHBS在37℃避光孵育1小时。然后用PBS洗涤3次。用激光共聚焦显微镜观察Ca2+浓度,分别观察拉力后、加入激动剂Yoda1后细胞内Ca2+浓度变化。5.使用Piezo1通道的激动剂Yoda1与抑制剂Gs Mtx4验证Piezo1通道对成骨分化的影响。在培养基中加入Piezo1特异性激动剂Yoda1,以实现对Piezo1的激活。借此观察Piezo1激活与非激活状态h LFSCs的成骨效能。6.构建sh RNA-Piezo1病毒,观察Piezo1敲除效果,通过WB实验检测慢病毒敲除效果。茜素红染色、ALP染色及WB实验检测成骨标志蛋白用于观察Piezo1敲除后,拉力下h LFSCs成骨分化的变化。结果1.从黄韧带组织提取、筛选的细胞形态为均一长梭形,漩涡状生长。经成骨诱导培养基诱导分化后,h LFSCs可以在茜素红染色、ALP染色下表现阳性。经成脂诱导培养基诱导分化后,油红O染色可见红色脂滴。经成软骨诱导培养基诱导分化后,h LFSCs可以形成软骨球,石蜡包埋、切片后,阿利新兰染色下可见阳性表达。h LFSCs表面标志物染色后,经流式细胞仪分析显示其CD90,CD29,CD73,和CD105阳性,CD34,CD45阴性。2.Co Cl2模拟的低氧条件及拉应力可以促进h LFSCs成骨分化。CCK8实验显示在Co Cl2浓度小于100μM时,可以Co Cl2对细胞的损伤没有影响。WB结果显示,Co Cl2可以产生和低氧培养箱一样的效果。在Co Cl2模拟的环境下,h LFSCs的成骨分化得到了加强。通过Flexcell的细胞拉伸仪对细胞进行牵拉,来观察机械刺激对h LFSCs产生的影响。分为诱导7、14、21天成骨分化和空白对照七组。我们发现,随着诱导时间增长,h LFSCs的成骨增强,ALP、茜素红染色阳性表达均增高,WB显示ALP、OPN、OST及RUNX-2（runt related transcription factor 2,RUNX-2）成骨标志蛋白表达也增高。相较于非拉力组,拉力组细胞在7,14,21天的茜素红染色阳性面积、ALP染色阳性面积上调,提示拉应力刺激可以促进h LFSCs成骨分化,证明了在相同诱导时间内,拉力促进了h LFSCs的成骨分化。WB实验去验证了成骨标志物的表达情况,结果显示相同诱导时间下,机械拉应力刺激下的h LFSCs的ALP、OPN、OST及RUNX2都明显增强。3.WB试验显示h LFSCs会表达一定水平的Piezo1通道蛋白。通过免疫荧光染色我们在共聚焦显微镜下发现Piezo1表达于细胞的表面及胞质。之后我们使用Ca2+指示剂检测Ca2+进入细胞的情况,来观测Piezo1的激活情况,我们发现当细胞经过拉力、Piezo1通道激动剂Yoda1处理后,Ca2+内流明显增强,提示拉应力、Yoda1会促进piezo1通道激活。4.Piezo1的激活可以促进h LFSCs的成骨效应。用激动剂Yoda1去处理h LFSCs,观察其成骨效能,经茜素红染色、ALP染色及WB实验验证后,发现当用Yoda1激活Piezo1后h LFSCs的成骨增强。随后,用Gs Mtx4去抑制拉力下Piezo1的激活,结果发现相较于拉力组,Gs Mtx4组在Piezo1受抑制后,h LFSCs茜素红染色、ALP染色阳性面积下降,WB显示ALP、OPN、OST及RUNX-2相关蛋白表达降低,提示Gs Mtx4抑制下成骨分化显著下降。5.sh RNA-Piezo1敲低h LFSCs的Piezo1通道蛋白表达后,拉力促进h LFSCs成骨分化的效应减弱。我们构建了可以敲低Piezo1表达的慢病毒Lv-Piezo1及空载病毒Lv-ctrl。转染后发现病毒均可在细胞中稳定表达,WB实验显示Lv-Piezo1可以敲低Piezo1通道蛋白的表达。选用Lv-Piezo1敲低细胞Piezo1通道的表达,接着免疫荧光染色证明及WB实验验证了Piezo1敲低成功。用机械拉应力刺激诱导未转染病毒组、Lv-ctrl组、Lv-Piezo1组h LFSCs成骨。最后茜素红染色、alp染色及WB结果显示相较于ctrl组及空载病毒组,Lv-Piezo1组成骨显著下降。空载病毒组与con组之间无差异。结论1.h LFSCs是一种具有成骨成脂成软骨分化能力的干细胞。2.Co Cl2可以模拟缺氧条件,Co Cl2模拟的缺氧及拉应力均可以促进h LFSCs的成骨分化,但拉应力条件下h LFSCs的成骨分化增强更明显。3.Piezo1通道蛋白在h LFSCs上表达,而且拉应力、激动剂Yoda1可以激活Piezo1通道的开放。4.激动剂Yoda1可以促进h LFSCs成骨分化,拉力促进h LFSCs的成骨分化可以被Gs Mtx4抑制,表明了Piezo1通道可以调控h LFSCs的成骨分化5.Lv-Piezo1转染后,h LFSCs的Piezo1通道表达被敲低。h LFSCs的Piezo1通道蛋白被敲低后,拉应力下的成骨分化减弱。表明了拉应力促进h LFSCs的成骨分化是通过激活Piezo1通道实现的。综上所述,拉应力、Co Cl2模拟的缺氧可以促进h LFSCs的成骨分化,其中拉应力促进作用更明显,而拉应力是通过Piezo1通道激活来调控成骨分化过程。这些结果为OLF的发病机制提出了新的解释,为预防和治疗OLF提供进一步的支持。