【摘 要】
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背景及目的动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种发生于血管内膜及内膜下的慢性炎症性疾病,以脂质沉积、斑块形成以及内膜增厚为主要病理特征,是导致心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）的主要原因。脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）作为一种高度促炎分子可诱导血管内皮细胞释放炎症因子,促进细胞黏附,造成血管内皮功能损伤,进而形成动脉粥样硬
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背景及目的动脉粥样硬化（Atherosclerosis,AS）是一种发生于血管内膜及内膜下的慢性炎症性疾病,以脂质沉积、斑块形成以及内膜增厚为主要病理特征,是导致心血管疾病（Cardiovascular disease,CVD）的主要原因。脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）作为一种高度促炎分子可诱导血管内皮细胞释放炎症因子,促进细胞黏附,造成血管内皮功能损伤,进而形成动脉粥样硬化。受体相互作用的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（Receptor interacting serine/threonine protein kinase1,RIPK1）是细胞死亡和炎症的关键介质,其通过介导炎症信号的传递,加重心脏损伤。同时,RIPK1和NF-κB之间存在密切关联,RIPK1可介导NF-κB信号通路激活,促进靶基因的转录活性,导致炎症和细胞死亡。MicroRNAs（miRNAs）是单链非编码的小分子RNA,大小约为21-23个碱基,具有调节细胞代谢、增殖、凋亡和分化的能力,近年来随着对miRNA研究的逐渐深入,我们发现其可通过与靶基因mRNA序列的3’UTR互补,抑制mRNA的翻译或诱导其降解,实现对靶基因的转录后调节。细胞焦亡是一种炎性程序性坏死,贯穿动脉粥样硬化发病的各个阶段。NF-κB信号通路的激活诱导炎症反应发生,炎症小体NLRP3将识别信号转导到炎症体接头ASC并激活Caspase-1,活化的Caspase-1切割GSDMD（Gasdermin D）的N端序列,使其结合到膜上产生膜孔,并释放IL-18,IL-1β等炎症因子,最终导致细胞焦亡。多项研究表明,内皮细胞焦亡在动脉粥样硬化发生发展的过程中发挥了重要的作用,因此,干预和调节细胞焦亡途径可能是防治动脉粥样硬化性疾病的新靶点。我们通过生物信息数据库Targescan及miRcode数据库均预测miR-22-3p可靶向调控RIPK1的表达,因此我们提出:miR-22-3p能否通过调控RIPK1的表达,激活NF-κB信号通路,从而对内皮细胞的焦亡产生影响呢?这需要我们进一步研究探讨,为以miR-22-3p、RIPK1、NF-κB信号通路为靶点的动脉粥样硬化的诊断治疗提供实验依据,发掘临床治疗新思路。方法1.探究LPS对HUVEC的焦亡作用。用Hoechst33342/PI荧光染色观察LPS对HUVEC细胞膜的损伤作用;采用qRT-PCR和Western Blot方法检测NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD的mRNA及蛋白表达水平;提取细胞上清液用ELISA检测炎症细胞因子IL-18、IL-1β表达水平。2.探究RIPK1、miR-22-3p及NF-κB通路在LPS作用的HUVEC焦亡中的表达变化。用qRT-PCR和Western Blot检测RIPK1的mRNA及蛋白表达水平;用Western Blot的方法检测NF-κB信号通路活化情况;qRT-PCR检测miR-22-3p的表达水平。3.探究过表达miR-22-3p对LPS作用的HUVEC中RIPK1、NF-κB通路及焦亡作用的影响。双荧光素酶报告基因验证miR-22-3p和RIPK1的靶向作用;将 HUVEC 分组进行转染:Control、LPS、LPS+Negative Control（NC）、LPS+miR-22-3p mimics、LPS+PEX-3 RIPK1、LPS+miR-22-3p mimics+PEX-3 RIPK1,用qRT-PCR和Western Blot方法检测各组中RIPK1的mRNA及蛋白表达水平;用Western Blot方法检测NF-κB信号通路活化情况;用免疫荧光染色方法观察各组中RIPK1表达水平;用qRT-PCR和Western Blot方法检测各组中NLRP3、Caspase-1、ASC、GSDMD 的 mRNA及蛋白表达。结果1.LPS诱导HUVEC的焦亡。2.LPS上调HUVEC中RIPK1的表达,下调miR-22-3p的表达,并激活NF-κB信号通路。3.RIPK1是miR-22-3p的靶基因;过表达miR-22-3p下调LPS诱导的HUVEC中RIPK1的表达,抑制NF-κB通路激活,减轻HUVEC的焦亡作用。结论过表达miR-22-3p与RIPK1靶向结合抑制NF-κB信号通路,减轻LPS诱导的HUVEC焦亡。
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