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第一部分KAT5抑制剂NU9056在未分化甲状腺癌进展和放化疗中的作用研究实验目的:未分化甲状腺癌（anaplastic thyroid cancer,ATC）起源于滤泡细胞,临床少见,属于高度恶性,生长较快,常广泛侵犯甲状腺周围组织,且发生颈部淋巴结转移及血行转移相当多见,综合治疗是其主要的治疗方式。但因各种治疗疗效极差,鲜有可以延长生命的治疗手段,ATC的治疗仍然是个难点。因此对于ATC患者来说,有必要探究驱动ATC进展的分子机制并寻找更好的治疗方法。前期研究表明KAT5可以促进ATC进展,KAT5可能会成为临床治疗ATC的潜在新靶点。本部分实验主要探讨KAT5抑制剂NU9056对ATC细胞生长、浸润、转移恶性表征的影响以及对放射治疗敏感性、化疗药物敏感性的影响。同时也探讨NU9056对ATC细胞裸鼠皮下移植瘤生长的影响。材料和方法:首先通过文献检索和搜索美国肿瘤基因组图谱（TCGA）中的数据,了解KAT5在甲状腺癌中的表达及与甲状腺癌患者预后的关系。之后通过Western blotting和qRT-PCR实验检测ATC细胞中本底KAT5表达,NU9056作用后ATC细胞组蛋白H4、H2A和乙酰化组蛋白H4、H2A表达,以确定NU9056能否有效阻断KAT5的活性。接着将不同浓度NU9056作用于ATC细胞8505C、CAL-62、转染KAT5-shRNA的CAL-62,同时作用于人正常甲状腺滤泡上皮细胞Nthy-ori 3-1,然后通过CCK-8实验、Colony formation实验、Transwell迁移和侵袭实验,研究KAT5抑制剂NU9056对ATC细胞生长、增殖、浸润、转移以及放化疗敏感性的影响。通过构建裸鼠异种移植瘤模型来研究NU9056对ATC的体内抗肿瘤活性。结果:（1）检索TCGA数据库显示KAT5异常表达的甲状腺患者预后差。（2）Western blotting和qRT-PCR实验均显示人ATC细胞中KAT5表达明显高于分化较好的正常人甲状腺细胞。（3）Western blotting实验显示NU9056通过抑制KAT5的乙酰转移酶活性而发挥作用。（4）CCK-8、Colony formation实验显示高表达KAT5可促进ATC细胞生长。NU9056通过抑制KAT5的乙酰转移酶活性、高度选择性抑制了高表达KAT5的ATC细胞活力和增殖能力,对低表达KAT5的正常甲状腺细胞和敲低KAT5表达的ATC细胞抑制作用减弱或无抑制作用。（5）Transwell迁移和侵袭实验显示NU9056可特异性抑制高表达KAT5的ATC细胞迁移、侵袭能力。（6）CCK-8、Transwell 迁移、Colony formation 实验分别显示出 NU9056 处理增加了 ATC细胞对化疗、放疗敏感性,而对KAT5低表达的正常甲状腺细胞没有放化疗增敏作用。（7）通过裸鼠体内实验表明NU9056在体内也抑制了 ATC增殖。结论:NU9056能够抑制KAT5高表达的ATC细胞生长、增殖、浸润、转移,并能够提高KAT5高表达的ATC细胞对放疗、化疗的敏感性。但对人正常甲状腺细胞和KAT5低表达的ATC细胞无影响。NU9056还能够使得ATC细胞裸鼠皮下移植瘤的生长得到抑制。KAT5高表达促进了 ATC进展,因而抑制KAT5可能作为未来ATC治疗的新决策。第二部分 NU9056抑制未分化甲状腺癌进展和提高放化疗敏感性的机制实验目的:基于研究小组前期研究结果（KAT5乙酰化并促进c-Myc蛋白表达）和借助高通量基因测序技术,鉴定出在ATC细胞过表达KAT5后以miR-202-5p表达上调较为明显。我们进一步假设KAT5及其下游作用靶点如c-Myc和miR-202-5p在ATC进展中起着重要作用。NU9056有可能通过调节KAT5及c-Myc和miR-202-5p的表达,从而抑制了 ATC进展和提高了放化疗敏感性。材料和方法:首先通过文献检索和搜索Oncomine数据库中有关ATC和分化型甲状腺癌数据,发现c-Myc在ATC及其他分化型甲状腺癌中表达差异明显。又通过Western blotting、细胞免疫荧光实验、免疫组织化学染色方法,检测NU9056作用后的ATC细胞和裸鼠皮下ATC移植瘤组织中c-Myc表达情况。采用Western blotting方法检测蛋白合成抑制剂放线菌酮对ATC细胞c-Myc蛋白表达的影响以期探索NU9056对c-Myc蛋白的作用及其机制。接着通过细胞转染、qRT-PCR、CCK-8和Transwell侵袭实验,来研究miR-202-5p在ATC进展中的作用和NU9056作用后对其表达的影响。最后使用JASPAR预测程序、双荧光素酶报告基因实验来预测并验证miR-202-5p的转录因子,从而探索KAT5调控miR-202-5p表达的机制。结果:（1）与其他类型甲状腺癌相比,ATC中c-Myc蛋白表达上调明显。（2）Western blotting和细胞免疫荧光实验显示NU9056以剂量依赖性的方式降低了 ATC细胞中c-Myc表达。免疫组化染色实验进一步验证了 NU9056降低了 ATC移植瘤组织中c-Myc表达。（3）Western blotting实验表明NU9056通过缩短ATC细胞c-Myc半衰期、降低了 c-Myc蛋白稳定性,从而使得c-Myc表达下调。（4）通过细胞转染、miRNAs高通量基因测序、qRT-PCR、CCK-8和Transwell侵袭实验显示出在ATC中,过表达KAT5可显著增加miR-202-5p表达,而NU9056抑制KAT5则显著降低了miR-202-5p水平,提示miR-202-5p可能是KAT5主要的下游靶点。（5）通过JASPAR预测程序,发现在miR-202-5p的上游启动子区域存在几个潜在的c-Myc结合位点,提示转录因子c-Myc可能调控了 miR-202-5p表达。（6）双荧光素酶报告基因实验显示,转染c-Myc显著提高了 miR-202-5p启动子的荧光素酶活性。c-Myc可促进miR-202-5p 转录。总之,KAT5通过乙酰化促进了 c-Myc蛋白表达;KAT5通过c-Myc在转录水平可上调miR-202-5p表达。KAT5抑制剂NU9056通过c-Myc在转录水平则下调了 miR-202-5p 表达。结论:KAT5抑制剂NU9056作用ATC后,抑制了 KAT5乙酰转移酶活性,使得c-Myc蛋白半衰期缩短、稳定性降低,从而下调了 ATC中miR-202-5p表达,抑制了 ATC进展和增加了 ATC细胞放疗、化疗敏感性。KAT5/c-Myc/miR-202通路在ATC进展中起着重要作用。NU9056可下调KAT5/c-Myc/miR-202通路抑制未分化甲状腺癌进展并增加其放化疗敏感性。