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第一部分 还原响应型支化聚β-氨基酯纳米复合物的制备与性能表征[目的]设计并合成含二硫键的还原响应型支化聚β-氨基酯(BPAE-SS),包载siMOF形成纳米复合物BSs NCs,随后用羧化甘露聚糖(Man-COOH)进行表面修饰,再对纳米复合物MBSs NCs的性能进行表征。[方法]通过化学方法合成黄色粘稠油状物BPAE-SS,利用凝胶渗透色谱法(GPC)测定聚合物的分子量(MWs)和还原敏感性,同时通过聚合物的回转半径(Rg)与分子量之间的构象曲线来反映聚合物的结构。将BPAE-SS溶解于醋酸缓冲液中,通过静电吸附作用与siMOF形成BSs NCs,然后在复合物表面修饰一层Man-COOH形成最终纳米复合物MBSs NCs。通过琼脂糖凝胶电泳和动态光散射来测量复合物按BPAE-SS与siMOF的不同质量比及Man-COOH与siMOF的不同质量比得出的结果来确定纳米复合物MBSs NCs的最佳比例。利用动态光散射和琼脂糖凝胶电泳实验来评估谷胱甘肽(GSH)处理前后纳米复合物BSs NCs的粒径变化与siRNA的释放情况,以及在不同浓度肝素钠中siRNA的释放情况。通过琼脂糖凝胶电泳实验和动态光散射来测定纳米复合物MBSs NCs的血清稳定性。[结果]BPAE-SS的分子量为21200,多分散性指数(PDI)为1.58。经二硫苏糖醇(DTT)处理后的BPAE-SS的分子量显著减小,证实了 BPAE-SS的还原敏感性。BPAE-SS的斜率在0.2左右,表明了其支化结构。琼脂糖凝胶电泳实验和动态光散射结果显示:(1)当 Man-COOH/BPAE-SS/siMOF 的质量比为 20/30/1 时,MBSs NCs获得最佳粒径为~170nm,电势电位为~6mV。与透射电子显微镜观察的结果一致。(2)GSH处理后的BSs NCs,粒径明显增大及siMOF缩合能力下降。此外,肝素钠置换实验证明siMOF释放所需的肝素钠浓度明显下降。(3)MBSs NCs在血清中保持良好的稳定性。[结论]MBSsNCs具有良好的支化结构与GSH响应性,在血清中保持稳定性,有利于siRNA在细胞内按需释放。第二部分MBSsm纳米复合物诱导的MOF/miR21基因沉默在巨噬细胞中的作用机制[目的]研究MBSsm纳米复合物诱导的MOF/miR21基因沉默在巨噬细胞中的作用机制。[方法]利用流式细胞术检测纳米复合物MBSs NCs递送siRNA进巨噬细胞的能力,使用共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)评估纳米复合物MBSs NCs细胞内释放能力及溶酶体逃逸能力。通过甘露糖靶向实验研究Man-COOH介导的纳米复合物MBSs NCs靶向内吞原理及细胞毒性实验(MTT)评估纳米复合物MBSs NCs的毒性。通过real-time PCR技术检测纳米复合物处理后巨噬细胞内MOF mRNA与KBTBD7 mRNA的表达情况,进而评估MBSs NCs与MBSm NCs的基因沉默效果。通过CLSM来检测MBSsm NCs在巨噬细胞中ROS清除能力。最后通过CLSM、real-time PCR及Western blot技术来研究MBSsm NCs在协调心肌微环境重塑方面的机制。[结果]流式细胞仪检测结果显示MBSs NCs具有较强的细胞内siRNA的递送能力,同时CLSM结果显示MBSs NCs在胞内可以很好地释放siRNA并且可以从溶酶体中逃脱。甘露糖靶向实验结果显示甘露糖浓度越高,MBSs NCs细胞摄取水平越低。MTT结果表明MBSs NCs无明显的细胞毒性。Real-time PCR结果显示当BPAE-SS/siMOF质量比为30时,基因沉默效率最佳,相比其它纳米复合物,经MBSs NCs处理的巨噬细胞内MOF mRNA与KBTBD7 mRNA表达最低,说明MBSs NCs具有很高的基因沉默效率。利用脂多糖(LPS)诱导巨噬细胞产生炎症反应后会释放大量的活性氧(ROS),通过CLSM观察发现经MBSsm NCs处理的巨噬细胞内的ROS被清除最多,见到很少的绿色荧光,表明MBSsm NCs联合递送siMOF与miR21可以有效地清除巨噬细胞内产生的ROS,减轻氧化应激反应。通过CLSM、real-time PCR及Western blot检测结果显示在模拟的心肌再灌注氧化和炎症环境下,MBSsm NCs高效地递送siMOF与miR21进巨噬细胞后清除ROS及减轻炎症反应,并促使巨噬细胞表型从M1(炎症型)转变为M2(抗炎型),同时通过巨噬细胞和心肌细胞之间的串扰进一步抑制心肌细胞的自噬。[结论]MBSsmNCs具有很高的转染效率且可以从溶酶体逃脱,靶向巨噬细胞可以高效地将siMOF与miR21递送至巨噬细胞内清除ROS及减轻炎症反应,促使巨噬细胞表型从M1到M2,以及减轻心肌细胞的自噬,从而协调心肌微环境的重塑。第三部分 MBSsm纳米复合物在治疗心肌缺血再灌注损伤中的研究[目的]研究MBSsm纳米复合物在治疗心肌缺血再灌注损伤中的作用。[方法]首先建立小鼠心肌缺血再灌注模型,共6组,分别为PBS组、MBSc组、BSsm组、MBSsm组、MBSs组、MBSm组。利用IVIS光学成像系统检测MBSs NCs递送Cy5-siRNA进心脏缺血组织的能力以及流式细胞术检测MBSs NCs靶向心肌巨噬细胞的能力。通过real-time PCR检测MBSsm NCs递送siMOF与miR21至心肌缺血组织后 MOF mRNA、Kbtbd7 mRNA、TNF-α mRNA、IL-6 mRNA、IL-10 mRNA、Arg1 mRNA的表达情况,Western blot技术测定MOF与KBTBD7蛋白表达情况。术后3天后通过心脏超声测量心脏射血分数(EF)和左室短轴缩短率(FS)来评估心脏功能。7天后将心脏组织切片进行组织学分析,通过三苯基四氮唑(TTC)染色测量心肌梗死面积,HE染色评估心肌组织损伤程度、TUNEL法检测心肌细胞凋亡程度、Masson’s trichrome(MT)染色评估心肌纤维化程度。[结果]通过IVIS光学成像系统检测结果显示MBSs NCs在心肌缺血组织中分布水平最高,流式细胞术检测结果显示MBSs NCs具有较强的靶向心肌巨噬细胞的能力。通过real-time PCR技术分析结果显示相对比另外5组,MBSsm组的基因沉默效果最好,Western blot技术检测结果显示MOF及KBTBD7蛋白表达水平最低。术后3天,TTC染色结果显示MBSsm组心肌梗死面积最小,同时心脏超声结果显示MBSsm组小鼠心脏功能基本恢复到正常水平。术后7天,组织学分析结果均显示MBSsm组的心肌组织跟正常心肌组织无明显差异。[结论]MBSsm纳米复合物将siMOF与miR21递送心肌缺血组织,通过减轻氧化应激反应和抑制炎症反应,协调心肌微环境重塑,减轻心肌缺血再灌注损伤,促进心脏功能的恢复。