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第一部分:嵌合抗原受体修饰T细胞治疗儿童及青少年复发/难治急性淋巴细胞白血病临床研究背景:急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）约占儿童时期急性白血病的65%～70%,儿童ALL经分层治疗,完全缓解率可达95%以上,5年以上无事件生存率可达80%～90%,但10%～20%为复发难治性B-急性淋巴细胞白血病（relapsed/refractory B cell acute lymphoblastic leukemia,r/rB-ALL）,尤其是接受异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation,allo-HSCT）之后复发的患者,预后更差。近几年嵌合抗原受体修饰 T 细胞（chimeric antigen receptor modified T cells,CAR-T）技术在r/r B-ALL的临床研究日益广泛。但在儿童患者应用中经验尚有限,其副作用及远期疗效的研究数据较少。目的:探讨CAR-T治疗儿童r/r B-ALL的短期及长期疗效和不良反应及其影响因素,提供早期干预依据和预测预后指标,进一步提高儿童白血病的治愈率。方法:1.本研究通过调阅医院信息系统电子病历资料,对住院和门诊患者进行观察记录,并对出院患者进行电话随访,以2016年8月～2020年6月年龄≤20岁的且接受CAR-T治疗的r/rB-ALL患者为研究对象,收集其基线资料,给予CD19CAR-T细胞治疗后,记录CAR-T细胞输注数量、输注后的不良反应,治疗效果,同时,随访治疗相关并发症的发生情况、相关检查结果、长期生存情况等,并进行相关性因素分析。2.运用SPSS26.0软件,利用卡方检验来分析早期的治疗效果及其相关因素、采用Kaplan-Meier生存分析和Cox 风险分析、Log-rank检验等方法对患儿总生存时间（OS）及无复发生存时间（RFS）,及显著相关的危险因素进行评估,并采用K-W检验分析不良反应的发生及其相关因素之间的关系,进一步通过ROC曲线建立发生严重CRS的预测模型。P＜0.05表示有显著性统计学差异,P值为双侧检验。结果:1.本研究纳入75例患者,中位随访时间800（60～1452）天。平均回输CAR-T细胞数量为5.2×106（5×106～1×107）/kg体重,CAR 阳性率在17.13%～74.38%之间。2.细胞因子释放综合征（cytokine release storm,CRS）的发生率69.3%,CRS严重程度与CAR-T治疗前肿瘤负荷高、CAR-T治疗后一周内细胞因子峰值高者相关,与输注的CAR-T细胞数量无明显相关。研究CAR-T治疗前后因子的变化与CRS发生的严重程度的ROC曲线发现:血清铁蛋白（serum ferritin,SF）、降钙素原（procalcitonin,PCT）、白细胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、白细胞介素-10（interleukin-10,IL-10）、干扰素 γ（interferon-γ,IFN-γ）等因子ROC曲线下面积（AUC）在0.8以上,诊断严重CRS的准确度较高。3.CAR-T治疗后75例患者中66例达完全缓解,完全缓解率88.00%。研究发现CART前骨髓原始细胞＜5%组早期治疗缓解率更高,而复发时间、复发次数、输注的CAR-T细胞数量、性别、年龄及高危分子遗传学因素等对早期缓解率无明显影响。4.长期生存情况:75例r/r B-ALL患者的中位RFS时间为8.67月,中位OS时间为13.33月,单因素分析显示,CAR-T前骨髓原始细胞＜5%、复发≥3次及CAR-T后桥接HSCT等与RFS及OS具有显著统计学意义,具有高危分子遗传学的变化是影响OS的不利因素,而接受HSCT后复发患者仍能得到较好的RFS。多因素分析表明CAR-T前复发次数≥3次是影响OS的独立危险因素,CAR-T后桥接HSCT是提高RFS和OS的独立危险因素。结论:CD19-CAR-T细胞对于儿童及青少年r/rB-ALL的治疗完全缓解率高,安全有效,CAR-T前白血病负荷及CAR-T后细胞因子峰值等影响CRS的严重程度;CAR-T前白血病负荷高影响早期缓解率;CAR-T前白血病负荷、复发次数、CART后未桥接移植和具有高危分子遗传学因素等是影响总生存期的不利因素;移植后复发患者仍能从CAR-T治疗中获益。第二部分CD4CAR-T细胞治疗CD4阳性T细胞恶性血液病的实验研究T细胞急性淋巴细胞白血病和T细胞淋巴瘤占儿童及青少年恶性血液病的一部分。目前T细胞淋巴瘤/白血病治疗的长期疗效不满意,尤其是复发难治性T细胞血液病尚无非常有效的治疗手段,针对这一大系列疾病的CAR-T治疗尚在探索中。CAR-T治疗的关键是找到合适的靶点。我们进行了以CD4为靶点的嵌合抗原修饰的T细胞（CD4CAR-T）细胞治疗恶性T细胞血液病的实验基础研究,以期为CAR-T治疗T细胞恶性血液病的研究提供实验依据。CD4抗原特异性表达于正常T细胞及一部分T细胞肿瘤细胞表面,造血干细胞表面不表达,是CAR-T治疗T细胞肿瘤的研究热点之一。本课题以慢病毒为质粒载体,使用小鼠抗人CD4单抗为胞外单克隆抗体单链可变区序列、4-1BB为共刺激分子、CD3ζ链作为胞内信号结构域来构建嵌合抗原受体。培养构建CD4CAR-T细胞,观察构建CD4CAR-T表达效率,然后使用培养的CD4CAR-T细胞杀伤CD4阳性KARPAS 299细胞,观察细胞因子的分泌及其靶向性杀伤作用,对CD4CAR-T细胞在体外和体内抗CD4+T细胞恶性血液病的作用进行初步研究。研究目的:探讨以CD4为靶点的嵌合抗原修饰的T细胞（CD4CAR-T）的构建,及其对T系恶性血液病的体外和体内杀伤功能,探讨以CD4为靶点的CAR-T细胞治疗T淋巴细胞恶性血液病的可行性。研究方法:确定CD4单抗的单链可变区片段、4-1BB共刺激分子及CD3ζ链序列,使用基因工程方法将其整合成一个整体序列,即CD4-CAR。通过DNA测序验证正确,然后将CD4-CAR片段克隆到慢病毒载体上。然后将穿梭质粒和包装质粒（pGag/Pol、pRev、pVSV-G）和CD4-CAR目的质粒共转染293T细胞,收集并浓缩慢病毒。进而使用慢病毒对活化T细胞进行感染,使用无血清培养基培养CD4CAR-T细胞,利用流式细胞术检测转染率,CD4CAR-T细胞的生长表达情况,CD4CAR-T细胞和KARPAS 299细胞共培养检测所构建的CD4CAR-T细胞体外杀伤活性;构建CD4+KARPAS 299细胞NGS小鼠白血病模型,研究CD4CAR-T细胞体内清除CD4+T细胞白血病的作用。结果:DNA测序表明慢病毒基因序列构建正确,我们成功制备了CD4CAR-T细胞,慢病毒转染T细胞后流式细胞术测转染效率73.6%,CD4CAR-T细胞与KARPAS 299-luc CD4+T细胞共培养后表现出了强大的CD4阳性恶性T淋巴细胞的杀伤活性。成功构建了 CD4+T细胞淋巴瘤NSG小鼠模型,观察到了CD4CAR-T细胞对T淋巴瘤小鼠的抗肿瘤细胞治疗作用,给予治疗的NSG小鼠生存期延长。结论:我们构建了靶向CD4的CAR-T细胞,并通过一系列的实验证明了对CD4+T系白血病细胞的抗肿瘤效果。通过体外共培养实验证实了 CD4CAR-T对CD4+细胞T系白血病细胞特异性细胞毒性,而且还通过NSG小鼠KARPAS 299白血病模型体内实验证实CD4CAR-T细胞可以显著抑制NSG小鼠T系恶性血液肿瘤的进展,延长其生存期。为CD4+T淋巴细胞恶性血液肿瘤的治疗提供了一种新的治疗方法。