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目的 卵巢癌是妇科三大恶性肿瘤之一,也是妇科致死率第一肿瘤,因其早期症状不典型,术后易复发的特性,严重危害女性生命健康。泛素特异蛋白酶7（USP7）为一类去泛素化酶,在既往的研究中被证明其蛋白水平出现异常高表达,且能够影响卵巢癌患者的预后,是卵巢癌诊治的潜在的诊疗靶点。UP-8A-j-2、UP-6U-3、UP-6E-5、UP-8A-a、UP-8A-2是五种新研制的靶向作用于USP7的抗肿瘤药物,其在卵巢癌中的作用尚不明确,本研究旨在探索USP7在卵巢癌患者中的蛋白水平情况以及其对患者预后的影响,并研究新型USP7变构位点2抑制剂对于卵巢癌的抑制情况以及抑制作用。方法 1.通过UALCAN数据库（http://ualcan.path.uab.edu/）进行数据分析,验证去泛素化酶7在卵巢癌中的蛋白表达水平。2.从上海芯超生物科技有限公司购置一块包含151例癌症标本的组织芯片,并对组织芯片进行筛选,剔除掉57例不符合病理要求的标本后对比在94例浆液性卵巢癌及子宫内膜样卵巢癌组织中USP7的蛋白表达水平,并探索USP7的蛋白水平表达能否对患者的预后产生影响。3.对鼠源性卵巢癌细胞ID8进行UP-8A-j-2、UP-6U-3、UP-6E-5、UP-8A-a、UP-8A-2等五种药物不同浓度及不同作用时间的刺激,通过MTT检测法检测五种药物对于卵巢癌细胞的抑制情况,并测算出药物对于肿瘤细胞的半抑制浓度,后挑选最合适的药物,用MTT实验检测该药物在人源性卵巢癌细胞SKOV3中是否起到抑制作用,并计算出半抑制浓度,为验证其在卵巢癌中的抑制效果,应用单细胞克隆实验检测该药物对卵巢癌细胞系SKOV3及A2780增殖作用的影响并计算集落形成率。4.使用染料Annexin V及PI通过流式细胞分析术检测药物UP-8A-j-2对SKOV3细胞的凋亡产生的作用。5.应用Western Blot的方法检测药物UP-8A-j-2对SKOV3细胞中USP7蛋白量的影响,已检测UP-8A-j-2是否能够通过降低USP7蛋白表达来发挥作用,后使用Si RNA制作USP7沉默的SKOV3细胞模型,并用Western Blot技术检测USP7是否被沉默。使用MTT检测法检测药物UP-8A-j-2在建立被Si RNA敲低了USP7的SKOV3细胞模型,并使用半抑制浓度的药物UP-8A-j-2刺激敲低了USP7的SKOV3细胞,观察敲低USP7后药物对于细胞的影响。结果 1.通过在UALCAN数据库进行生物信息学检索,共找到卵巢癌样本100例以及卵巢样本25例,两组数据中USP7在卵巢癌组织中的蛋白表达水平高于卵巢样本,差异存在统计学意义。2.在包含151例癌症标本的组织芯片中,剔除不符合需求的病理类型的标本共51个后,本研究将这其中的97份浆液性卵巢癌及子宫内膜样卵巢癌的标本进行分析,在剔除了3份未取到癌巢的标本后得出结果,分析表明在浆液性卵巢癌及子宫内膜样卵巢癌中,USP7蛋白水平高表达的患者的总生存期及无进展生存期均低于USP7蛋白水平低表达者,这说明USP7在组织中的高表达能够导致患者的不良预后。3.MTT实验的结果表明,在鼠源性卵巢癌细胞ID8中,UP-8A-j-2、UP-6U-3、UP-6E-5、UP-8A-a、UP-8A-2、UP-8A-2-1等六种药物分别能够以时间梯度和浓度梯度对卵巢癌细胞产生抑制作用,UP-8A-j-2、UP-6U-3、UP-6E-5、UP-8A-a、UP-8A-2等五种药物在ID8细胞中的IC50分别为10.80μM、21.67μM、22.48μM、32.32μM、36.91μM、40.76μM。其中药物UP-8A-j-2对于卵巢癌细胞的抑制作用较为显著,且效果更为稳定,因此选作本次主要研究的药物。在人源性卵巢癌细胞SKOV3中行MTT进行验证,发现其在SKOV3细胞中存在抑制作用,且半抑制浓度为30.51μM。细胞克隆实验的结果证明,药物UP-8A-j-2能够抑制卵巢癌细胞的增殖,其结果能够佐证MTT实验的结果,说明UP-8A-j-2能够通过抑制USP7来抑制卵巢癌的增殖。在A2780细胞中药物刺激组与对照组的集落形成率分别为64%以及28%;在SKOV3细胞中药物刺激组与对照组的集落形成率分别为38%以及8%。4.通过流式细胞分析术分析得出结果,在经过48小时的UP-8A-j-2刺激的SKOV3细胞较阴性对照组的细胞发生凋亡的概率,发现在30μM药物UP-8A-j-2作用48小时后细胞凋亡率占22.84%而对照组中凋亡率为12.02%,药物刺激组的细胞凋亡率明显高于对照组,提示该药物能够促进卵巢癌细胞发生细胞凋亡。5.在Western Blot实验中,药物UP-8A-j-2作用于SKOV3细胞显示其作用效果中USP7蛋白表达量与对照组无显著差异,说明药物作用原理并非通过抑制USP7蛋白合成。通过Western Blot实验检验,Si RNA沉默USP7组中USP7的蛋白表达被沉默。通过Si RNA的方式敲低SKOV3中的USP7蛋白表达,并对敲低了USP7的模型进行药物UP-8A-j-2刺激,结果显示相比于未敲低的细胞,敲低了USP7的SKOV3被抑制情况降低,以上结果说明药物UP-8A-j-2对于USP7的抑制具有特异性。结论 1.USP7在卵巢癌组织中的蛋白表达水平高于其在正常卵巢癌组织中的蛋白表达水平,且会导致患者的不良预后。2.UP-8A-j-2、UP-6U-3、UP-6E-5、UP-8A-a、UP-8A-2等五种药物能够在体外抑制卵巢癌细胞的增殖,其中UP-8A-j-2的效果最佳。3.UP-8A-j-2能够促进卵巢癌细胞产生凋亡。4.UP-8A-j-2能够通过抑制USP7从而抑制卵巢癌细胞增殖。