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颞下颌关节(Temporomandibular joint TMJ)在颅颌面生长及功能方面起着重要的作用。不同于长骨关节,当颞下颌关节受到创伤后,其关节腔内环境发生改变,极易引起下颌骨髁突软骨(Mandibular condylar cartilage,MCC)发生病理性改变,可能导致颞下颌关节骨关节炎(Temporomandibular joint osteoarthritis,TMJ OA)等疾病的发生,进而下颌骨髁突软骨失去生长能力而加速了软骨内成骨(EO,Endochondral Ossification)[1],最终髁突病理性钙化。正常软骨组织中,II型胶原(Type II collagen,Col II)占整个软骨干重的60%,Col II的裂解和崩塌将直接导致软骨结构被破坏,同时加速炎症的激发导致疾病的恶性循环,最终软骨钙化。基质金属蛋白酶13(Matrix metalloproteinases-13,MMP-13)对多种广泛存在于细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)中的蛋白具有强有效的降解作用[2],尤其对Col II的破坏,是其他胶原酶的10~30倍[3]。血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)可以在促进软骨血管化的同时促进MMP-13的产生、抑制其抑制剂TIMP-1及TIMP-2的表达,加速OA进程[4]。透明质酸(Hyaluronic Acid,HA)可以有效缓解OA的进程[5],TGF-β1则通过下调mir-140的活性加速OA进程[6]。本课题采取下颌骨髁突软骨及长骨软骨小组织块体外培养的方法,检测下颌骨髁突软骨钙化过程中及长骨软骨中VEGF及MMP-13的表达变化。接着通过在培养基中加入相应浓度的HA或TGF-β1,观察下颌骨髁突软骨的钙化情况,并检测VEGF/MMP-13蛋白在其中的表达变化。为今后临床上对TMJ OA的研究和诊治提供一定的理论依据。实验方法:本实验均采用小组织块体外培养的方法。实验一:在超净工作台内,于体视显微镜下将新生3d的昆明小鼠仔鼠断头处死,取其下颌骨髁突软骨及长骨软骨(胫骨、股骨头软骨)组织。将获得的软骨小组织块随机均分为2组,设置其中一组为“未培养对照组”,给予直接固定;另一组设置为“培养对照组”置于空白的IMDM培养液中行体外培养,6周后采用体视显微镜观察其形态学变化,HE染色观察组织结构变化。通过茜素红及碱性磷酸酶染色(ALP)染色判断组织钙化变化。使用IPP6.0(Image-Pro plus6.0)软件测量软骨面积的变化情况。运用免疫组织化学染色的办法并通过阳性细胞计数,检测培养对照组髁突及长骨软骨组织中VEGF及MMP-13蛋白的表达变化;实验二:仅对有钙化发生的下颌骨髁突软骨加以研究。在实验一的基础上,设置该组髁突软骨为HA组,在IMDM培养液中加入0.5mg/ml的HA,体外培养6周后,观察下颌骨髁突软骨的钙化情况,采取同样的方法检测VEGF及MMP-13蛋白的表达变化,并与培养对照组的结果行比较分析;实验三:将5ng/ml的TGF-β1加入培养基中,培养6周后观察TGF-β1作用下下颌骨髁突软骨的钙化情况,采用与实验一相同的方法检测VEGF/MMP-13的表达变化,并与培养对照组行比较分析;所有数据通过SPSS软件行统计学分析,研究VEGF/MMP-13在体外培养的下颌骨髁突软骨钙化过程中的表达变化。实验结果:1、髁突软骨在体外培养6w后软骨发生钙化,VEGF及MMP-13的表达量增加。髁突软骨组织在空白的IMDM培养液培养6w后(培养对照组),体视显微镜下观察发现在髁突软骨内出现拱形的高密度光阻射区。ALP及茜素红染色表明,与培养前(未培养对照组)比较,培养6w后所形成的光阻射区为钙化区域。HE染色示:培养6w后,髁突软骨层变薄,层次不清,部分软骨细胞出现肥大分化,部分ECM区域出现嗜碱性蓝染。免疫组化及阳性细胞计数分析示:VEGF及MMP-13阳性细胞个数在培养6w后均有增加,软骨钙化区域ECM中VEGF及MMP-13阳性表达。说明下颌骨髁突软骨钙化的发生伴随着ECM中VEGF/MMP-13的阳性表达和阳性细胞的增多。2、长骨软骨未查及钙化发生,软骨组织表面积增大。长骨软骨(胫骨、股骨头软骨)在培养6w后,在体视显微镜下,均未发现光阻射区形成,ALP及茜素红染色结果证明,长骨软骨在培养后未发生钙化。HE染色示:长骨软骨在培养6w后,层次依然清晰,ECM区域未查及嗜碱性蓝染。免疫组化及阳性细胞计数结果表明,培养6w后,长骨软骨VEGF及MMP-13阳性细胞增加。测量软骨表面积结果表明,培养6w后长骨软骨表面积明显增加。证明长骨软骨与髁突软骨不同,在相同培养环境下,长骨软骨可以继续生长,未发生钙化。3、HA组下颌骨髁突软骨基质未发生钙化,同时伴随着VEGF/MMP-13阳性细胞数减少。髁突软骨组织在配有HA的IMDM培养液培养6w后,体视显微镜下未观察到光阻射区的形成,ALP及茜素红染色均未查及髁突软骨钙化区域,HE染色结果表明,髁突软骨在含有HA的培养液中培养6w后,软骨增厚,层次尚可辨认,ECM内嗜碱性蓝染阴性。测量软骨表面积结果表明,培养6w后,髁突软骨表面积有所增加。说明在HA的作用下,体外培养的下颌骨髁突软骨未发生钙化。免疫组化染色结果显示,HA组髁突软骨ECM中未检测到VEGF及MMP-13蛋白的表达。阳性细胞计数的结果表明,与培养对照组比较,HA组的下颌骨髁突软骨中VEGF及MMP-13阳性细胞数减少。4、TGF-β1可以促进下颌骨髁突软骨钙化,同时伴随着VEGF/MMP-13表达升高。髁突软骨组织在加有TGF-β1的IMDM培养液培养6w后,体视显微镜下光阻射区形成,且面积与较培养对照组相比呈现出增大的趋势。ALP及茜素红染色结果证明,TGF-β1组髁突钙化更为严重。HE染色提示髁突软骨肥大样分化,ECM区域大片嗜碱性蓝染,软骨细胞层次混乱,部分软骨细胞破裂。说明TGF-β1可以促进髁突软骨的钙化。免疫组化染色结果显示,软骨钙化的区域可以检测到VEGF/MMP-13的表达。阳性细胞计数的结果显示,TGF-β1组下颌骨髁突软骨中VEGF及MMP-13的阳性细胞数较培养对照组增多。实验结论:1、下颌骨髁突软骨不同于长骨软骨,在体外培养条件下,髁突发生钙化;而长骨软骨能够继续生长而未有钙化发生。故实验二、实验三仅对有钙化表现的髁突做进一步研究。2、下颌骨髁突软骨钙化过程中,其软骨细胞外基质钙化的区域伴有VEGF/MMP-13阳性表达。3、在体外培养条件下,HA组下颌骨髁突软骨未有钙化发生,仅有少量VEGF/MMP-13的阳性细胞表达,VEGF及MMP-13的阳性细胞数减少。4、在体外培养条件下,TGF-β1可以促进下颌骨髁突软骨钙化的发生,且在软骨细胞外基质钙化的区域可以检测到VEGF/MMP-13的表达,VEGF及MMP-13的阳性细胞数增多。