类胡萝卜素合成过程需要很多酶进行催化反应,八氢番茄红素合成酶/番茄红素环化酶（CrtYB）与八氢番茄红素脱氢酶（CrtI）是众多关键催化酶中较为关键的两种酶,它们主要参与类胡萝卜素下游合成途径中重要前体物质的生成,具有重要意义。本课题组从草莓果实上分离发现并保藏的一株掷孢酵母（Sporidiobolus pararoseus）野生型菌株,代号NGR,菌保中心编号:CGMCC 2.5280,前期试验已成功分析并克隆得到了crt YB与crtI基因并验证了它们的功能。对CrtYB蛋白进行保守域分析发现具有三个相对独立的保守域,分别是两个重复的Car R番茄红素环化酶结构域和一个八氢番茄红素合成酶结构域（从N端-C端）。本文通过定点突变技术、蛋白截短试验及亚细胞定位研究得出以下结论:（1）利用重叠延伸PCR技术将位于CrtYB蛋白C端八氢番茄红素合成酶结构域的第322位氨基酸由“D”（天冬氨酸）突变为“P”（脯氨酸）,利用异源互补检测法及高效液相色谱法对其进行了功能验证,确定了突变基因crt YBD322P的八氢番茄红素合成酶与番茄红素环化酶功能丧失。结合之前研究分析了八氢番茄红素合成酶功能丧失的原因,证明第322位突变位点是影响CrtYB蛋白各个结构域之间相互关系的关键位点。（2）通过对全长蛋白进行截短表达成功构建质粒p ET32a-Crt Y1B与p ET32a-Crt B,并进行了原核蛋白表达。通过异源互补检测法与高效液相色谱技术对截短蛋白进行了功能验证,确定了截短蛋白Crt Y1B的八氢番茄红素合成酶与番茄红素环化酶功能丧失,在番茄红素的基础上还产生了另外一种色素,我们推测其为某种异构体;截短蛋白Crt B的八氢番茄红素合成酶功能丧失。除此之外表达截短蛋白的菌株番茄红素积累量得到了提高:携带质粒p ET32a-crt Y1B+p AC-LYC的重组大肠杆菌的番茄红素积累量显著增加,番茄红素积的积累量可达50.05μg/g,高于携带质粒p ET32a+p AC-LYC的重组大肠杆菌的34.39μg/g。对共表达截短蛋白与p AC-LY质粒的大肠杆菌菌株进行实时荧光定量PCR结果显示,表达截短蛋白Crt Y1B的大肠杆菌中质粒p AC-LYC携带的crt E、crtI与crt B基因的表达量显著上调;表达截短蛋白Crt B的大肠杆菌中质粒p AC-LYC携带的crt E与crtI基因的表达量显著上调,crt B基因同样上调但并不显著。对CrtYB蛋白进行截短试验表明双功能蛋白N-端区域可能不仅是番茄红素环化酶结构域,对八氢番茄红素合成酶活性至关重要,即蛋白的N-端结构域可能同时具有两个功能:番茄红素环化酶和八氢番茄红素合酶的膜定位功能。（3）对CrtYB与CrtI蛋白进行蛋白互作与亚细胞定位显示:这两种蛋白之间不存在相互作用,但同这两种蛋白亲缘关系较近的具有相同功能的其他酵母的蛋白互作网络分析结果显示这两种蛋白均与类胡萝卜素合成途径中的催化前体物质生成的可溶性酶蛋白存在互作;蛋白的亚细胞定位试验结果显示这两种蛋白定位于细胞质膜与细胞器膜,与BUSCA网站预测结果一致。综上,我们推测在掷孢酵母中存在这样一种类胡萝卜素合成机制:IPP与DMAPP生成GGPP的过程发生在细胞质中,而催化这一系列反应的酶均为可溶性酶,因此可能相互组合构成一个多酶复合体完成GGPP的生成过程;生成的GGPP经过定位于膜上的CrtYB与CrtI蛋白的催化作用下生成番茄红素、β-胡萝卜素、圆酵母素和红酵母红素并在催化过程中被转运至膜内疏水层中进行储存。