第一部分GM1预处理对布比卡因诱导的N2a细胞神经毒性的保护作用第一节建立体外布比卡因诱导致N2a细胞损伤模型目的:建立体外布比卡因诱导致N2a细胞损伤模型,观察布比卡因致N2a细胞神经毒性损伤效应。方法:使用含不同浓度布比卡因的培养液分别孵育N2a细胞不同时间段,用相差倒置显微镜观察细胞形态学变化;CCK-8法检测布比卡因对N2a细胞活力影响的时间-浓度效应;流式细胞仪检测各组N2a细胞的凋亡率变化。结果:随着布比卡因浓度的增大和作用时间的延长,N2a细胞形态学出现细胞皱缩、变圆,细胞突触收缩或断裂,折光性下降等变化。CCK-8法检测N2a细胞活力,随着布比卡因浓度升高和作用时间的延长,细胞活力逐渐降低。与对照组相比较,400μM、800μM、1200μM和1600μM布比卡因组细胞在孵育12 h、24 h和36 h后细胞活力均明显进行性降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,其中,在800μM布比卡因孵育细胞24时组,N2a细胞活力下降至（51.2±7.3）%,接近布比卡因的IC50值。采用流式细胞仪检测细胞凋亡率,随着布比卡因孵育浓度增加,N2a细胞的凋亡率随之升高,在800μM浓度布比卡因孵育N2a细胞24 h组,细胞凋亡率较对照组明显增高,与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;继续增大布比卡因孵育浓度,N2a细胞的凋亡率随之显著升高。结论:布比卡因对N2细胞存在毒性损伤作用,且其对N2a细胞的毒性作用呈时间和剂量依赖性。本课题选取800μM浓度的布比卡因作用N2a细胞24小时建立布比卡因神经毒性实验模型,进行后续研究。第二节建立GM1对布比卡因诱导N2a细胞毒性的保护模型目的:明确GM1对布比卡因的保护作用,筛选GM1对布比卡因神经毒性的最佳保护浓度。方法:根据上节实验结果,本节实验使用不同浓度的GM1预干预N2a细胞24 h,再加入含800μM浓度布比卡因的培养基孵育细胞24 h。用相差倒置显微镜观察细胞形态学变化;CCK-8法检测N2a细胞活力变化;JC-1检测线粒体膜电位的变化;流式细胞仪检测各组细胞的凋亡率情况。结果:在0.1、1μM浓度的GM1预处理组,N2a细胞形态与布比组变化不明显,随着GM1预处理浓度的增大,在10μM和20μM浓度GM1组,N2a细胞形态较布比组改善明显,N2a细胞及其突触仍然呈多态性表现。采用CCK-8法检测N2a细胞活力显示,布比组细胞活力明显受到抑制,在使用含0.1、1μM浓度GM1预处理细胞后,其细胞活力较布比卡因组有一定的恢复,但差异并无统计学意义;随着GM1孵育浓度的增大,在10μM浓度的GM1预处理组,N2a细胞活力较布比组明显改善,差异有统计学意义（P＜0.05）,继续增加GM1浓度至20μM,N2a细胞活力并未随GM1浓度增加而进一步升高。我们选取10μM浓度的GM1预处理N2a细胞24 h,再加入800μM布比卡因孵育N2a细胞24h,分别采用JC-1法检测线粒体膜电位变化和流式细胞仪检测细胞凋亡率变化情况,结果显示,当使用10μM浓度的GM1预处理N2a细胞后,布比卡因致N2a细胞线粒体膜电位去极化作用较前明显降低,同时,细胞凋亡率较前明显下降,与布比组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:在一定剂量范围内,GM1预处理能改善布比卡因对N2a细胞活力的抑制,减少线粒体膜电位的去极化作用,有效降低布比卡因对N2a细胞的凋亡率,减轻布比卡因引起的神经毒性作用。第二部分GM1预处理改善布比卡因毒性损伤的机制研究第一节布比卡因对内质网应激PERK/eIF2α/ATF4信号通路的影响目的:探讨内质网应激PERK/e IF2α/ATF4信号通路在布比卡因诱导的神经毒性中的作用。方法:根据第一部分实验,建立N2a细胞布比卡因神经毒性损伤模型,并分别使用内质网抑制剂（4-PBA）或PERK特异性抑制剂（GSK2656157）抑制内质网应激反应,使用Western blot法检测内质网信号通路蛋白PERK,p-PERK,p-e IF2α,ATF4在各组的变化情况;并且采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率变化情况。结果:Western blot结果显示,在布比卡因组,p-PERK水平明显增加,pPERK/PERK相对水平明显升高,同时,p-e IF2α及ATF4表达水平也明显升高,与对照组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）;在4-PBA和GSK2656157预处理细胞组,其p-PERK、p-e IF2α及ATF4水平降低,与布比卡因组比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。用免疫荧光法检测ATF4蛋白相对表达量,其结果与Western blot检测一致。同时,流式细胞术结果显示,在布比卡因组细胞凋亡率明显增加,其与对照组细胞凋亡率比较,差异有统计学意义（P＜0.05）。而当使用4-PBA或GSK预处理抑制内质网应激激活,再使用布比卡因孵育细胞,细胞凋亡率较布比卡因组下降,其差异有统计学意义（P＜0.05）。结论:布比卡因可以通过上调PERK磷酸化水平,并激活下游信号通路信号蛋白介导内质网应激进程,引起内质网依赖途径的细胞凋亡率增加,产生细胞毒性损伤作用。第二节PERK/e IF2α/ATF4通路在GM1减轻布比卡因神经毒性中的作用目的:阐明GM1对布比卡因的保护作用是否与内质网应激有关,并探讨PERK/e IF2α/ATF4信号通路介导的细胞凋亡途径在其中的作用。方法:建立N2a细胞布比卡因神经毒性损伤模型,并分别使用GM1和TM预干预N2a细胞。Western blot法检测内质网信号通路蛋白PERK,p-PERK,p-e IF2α及ATF4表达情况,同时,检测细胞凋亡通路标志物蛋白CHOP,Casepase-3,Bax,Bcl-2变化情况;免疫荧光法检测p-PERK磷酸化水平。结果:Western blot结果显示,与对照组和GM1组比较,布比卡因组细胞pPERK/PERK,p-e IF2α及ATF4蛋白表达量明显上调,差异有统计学意义（P＜0.05）。当GM1预处理细胞后,再使用布比卡因孵育细胞,结果显示,pPERK/PERK,p-e IF2α及ATF4蛋白的升高程度较单独使用布比卡因组明显降低,差异有统计学意义（P＜0.05）,GM1预处理可以减轻布比卡因导致的内质网应激反应,抑制PERK/e IF2α/ATF4信号通路过度激活,此外,与对照组比较,布比卡因组促凋亡蛋白CHOP、Casepase-3、Bax表达量明显上调,而抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降,差异有统计学意义（P＜0.05）。当使用GM1预处理细胞后,再使用布比卡因孵育细胞,结果显示,促凋亡蛋白CHOP,Casepase-3,Bax表达量升高程度比单独使用布比卡因组明显降低（P＜0.05）,Bcl-2表达量在GM1预处理组明显增加,差异有统计学意义（P＜0.05）。而在TM+GM1+BUP组,当我们使用内质网激活剂（TM）激活内质网应激反应后,GM1对布比卡因的抗凋亡作用被逆转。结论:GM1预处理减轻布比卡因诱导的细胞神经毒性作用,其保护机制可能与其抑制内质网应激反应,改善细胞凋亡率有关,其中PERK/e IF2α/ATF4信号通路介导的内质网-细胞凋亡途径在其中具有重要调控作用。