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阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,AD）,俗称老年痴呆,是一种发病原因不明的中枢神经系统进行性发展的神经退行性疾病,患者出现记忆力衰退,继而出现失语、运动障碍及生活难以自理,严重者会出现行为异常,对患者及其家属生活质量、精神以及经济上带来沉重的负担。目前全世界痴呆患者至少达在5000万之多,并且由于目前尚无有效防治手段呈持续增长状态,日益成为严重的全球公共卫生问题。因此,寻找有效的手段预防、延缓以及治疗AD尤为重要。酵母β-葡聚糖是一种具有强大的生物学活性的多糖,由于其具有抗炎、抗肿瘤、抗癌、免疫调节以及调节肠道菌群和胰岛素信号通路的众多生物学作用被添加到多种功能食品中。尤其是酵母β-葡聚糖调节肠道菌群和胰岛素抵抗能力近些年在代谢性疾病中得到较多研究。基于脑-肠-微生物群（BGM）轴概念的提出,肠道菌群被证明在AD的发生发展中起到重要作用。同时脑内胰岛素抵抗与AD的病程进展紧密相关,可能是AD早期干预的重要靶点,并提出AD可能是“3型糖尿病”。酵母β-葡聚糖在高脂模型小鼠中证实能调节肠道菌群紊乱并降低胰岛素抵抗,但其是否对AD这类神经退行性疾病的认知障碍具有保护作用以及相关的机制并不明确。因此,探究酵母β-葡聚糖对AD这类神经退行性疾病的认知障碍的潜在保护作用及其相关机制,具有十分重要的生物学意义,为AD的防治以及酵母β-葡聚糖的功能应用提供新思路。综上所述,本文从酵母β-葡聚糖对Aβ诱导AD模型小鼠认知障碍的影响,对Aβ诱导AD模型小鼠肠道菌群失调的影响,以及对胰岛素信号通路的调节三方面出发,研究酵母β-葡聚糖对AD的保护作用及相关机制的初步探索。第一部分酵母β-葡聚糖干预对Aβ诱导的阿尔茨海默病模型小鼠认知功能的影响目的:探索酵母β-葡聚糖（Yeastβ-Glucan）对双侧侧脑室注射β-淀粉样蛋白（Amyloid-β,Aβ）构建的阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）模型动物学习和记忆的影响。方法:SPF级C57BL/6J雄性小鼠40只,按体重随机分为四组:对照组、AD组、小分子酵母β-葡聚糖（200 KDa,S-β-Glu）干预组以及大分子酵母β-葡聚糖（800 KDa,M-β-Glu）干预组。对AD组、S-β-Glu组和M-β-Glu组小鼠通过立体定位仪进行双侧侧脑室注射5μg/μL老化Aβ1-42,每侧注射5μL;而对照组小鼠则通过立体定位仪进行双侧侧脑室注射等量生理盐水。术后第二天,对照组和AD组小鼠每天以灌胃方式给予双蒸水（20μg/kg）,干预组小鼠每天以灌胃方式分别给予用双蒸水混悬的S-β-Glu悬浊液（100 mg/kg BW）和M-β-Glu悬浊液（100 mg/kg BW）,干预4周,并记录小鼠体重和进食量。干预结束后,先通过旷场实验检测小鼠自发活动,再通过十字高架实验检测小鼠焦虑样行为,然后通过Morris水迷宫评估四组小鼠的空间学习和记忆能力情况。通过苏木素-伊红染色来检测小鼠脑部神经元形态结构,分析神经元细胞坏死和凋亡的情况;酶联免疫吸附实验（ELISA）测定小鼠海马组织中Aβ水平,并结合Aβ免疫组化进行分析;免疫印迹（WB）检测小鼠海马组织Tau蛋白含量及磷酸化情况。结果:对小鼠体重和进食量的跟踪记录分析表明,脑室内注射Aβ在体重和摄食方面对小鼠无显著影响,同时S-β-Glu和M-β-Glu干预对小鼠摄食和体重无毒副作用。旷场实验和十字高架实验分别表明,与对照组相比,AD组、S-β-Glu及M-β-Glu组小鼠的自发活动和焦虑样情绪均无明显改变;证明AD造模以及干预物对小鼠水迷宫行为影响具有可靠性。在水迷宫定位巡航实验中,AD组小鼠到达平台的潜伏期和游泳路径较对照组显著延长（均为P＜0.01）;并且在水迷宫空间探索试验中,AD组小鼠在目标象限所占时间比和穿越平台次数较对照组明显减少（P＜0.01和P＜0.05）;与AD组相比,S-β-Glu及M-β-Glu干预能明显的缩短小鼠到达平台的潜伏期（均为P＜0.05）,并增加其穿越平台次数（P＜0.05和P＜0.01）以及目标象限时间比（P＜0.05和P＜0.01）;以上结果提示S-β-Glu及M-β-Glu干预能明显改善AD组小鼠空间学习和记忆能力。HE染色结果显示AD组海马组织神经元出现明显损伤,表现为明显的固缩、溶解、细胞膜以及细胞核边界模糊等现象,而S-β-Glu及M-β-Glu处理可显著减轻Aβ引起的神经元损伤。ELISA结果以及Aβ免疫组化染色结果显示,AD组小鼠海马组织内Aβ含量较对照组明显增加（P＜0.01）,而与AD组相比S-β-Glu及M-β-Glu可显著降低Aβ在海马组织内含量（P＜0.01和P＜0.01）。WB结果显示,AD组小鼠海马组织中p-TauSer404水平较对照组显著升高（P＜0.05）,而与AD组相比S-β-Glu及M-β-Glu可降低Tau蛋白Ser404磷酸化水平（P＜0.05和P＜0.01）。结论:酵母β-葡聚糖干预改善侧脑室注射Aβ诱导AD模型小鼠空间学习和记忆能力,通过降低AD模型小鼠海马组织中Aβ含量、减少Tau蛋白过度磷酸化,并对神经元具有保护作用。第二部分酵母β-葡聚糖干预对Aβ诱导的阿尔茨海默病模型小鼠肠道菌群及代谢产物的影响目的:探讨侧脑室注射Aβ对C57小鼠肠道菌群及其代谢产物短链脂肪酸（short-chain fatty acids,SCFA）的影响以及酵母β-葡聚糖干预对Aβ诱导的AD小鼠肠道菌群失调的影响,同时比较不同分子量酵母β-葡聚糖对肠道菌群的作用是否有差异。方法:动物分组及受试物同第一部分,S-β-Glu（200 KDa）及M-β-Glu（800KDa）干预4周后,用代谢笼严格按要求收集小鼠的粪便,收取粪便后立即放入干冰中冷冻,4小时之内存放于-80°C。通过16S r RNA基因测序手段技术分析小鼠肠道菌群的组成,通过气相色谱串联质谱（GS-MS）技术测定小鼠粪便及海马组织中SCFAs的含量。小鼠海马组织中炎性因子水平通过MSD电化学发光检测。通过Chao1指数以及Simpson指数评估小鼠粪便样品的α多样性,PCo A分析与Anosim分析评估小鼠粪便样品的β多样性。利用秩和检验在属水平上选出差异物种,Spearman相关分析进一步分析差异物种的变化与AD相关的病理和认知能力的关联性,并将差异物种与PICRUSt软件预测的代谢通路进行关联性分析,用来反映差异物种对代谢通路的影响。结果:与对照组相比,Aβ注射不会显著改变小鼠肠道菌群α多样性,但会显著改变小鼠肠道菌群β多样性。而S-β-Glu和M-β-Glu干预可以缓解这一现象（Anosim分析R=0.254,P=0.001）;并且与对照组相比,Aβ注射选择性改变了正常小鼠肠道菌群的组成,造成肠道菌群失调。在门水平上,AD组小鼠拟杆菌门相对丰度降低,而厚壁菌门相对丰度增加;在属水平上Oscillibacter,Mucispirillum,Alistipes,Anaerotruncus,Rikenella和Butyricicoccus的相对丰度增加（P＜0.01,P=0.05,P＜0.001,P＜0.01,P＜0.001,P＜0.01）,有益细菌（Lactobacillu,Bifidobacterium,and Saccharibacteria＿genera＿incertae＿sedis）的相对丰度降低（P＜0.001,P＜0.01,P＜0.01）。S-β-Glu和M-β-Glu干预后,可以改善上述由Aβ导致的肠道菌群紊乱的现象。具体表现为拟杆菌门相对丰度显著增加（P＜0.05,P＜0.05）,厚壁菌门相对丰度显著降低（P＜0.05,P＜0.01）,并降低这些由Aβ引起的增加的条件致病菌的丰度,使其趋近于对照组（P＞0.05）。Oscillibacter和Rikenella菌属相对丰度在S-β-Glu干预组小鼠和M-β-Glu干预组小鼠差异具有显著性（P＜0.01,P＜0.05）。同时,S-β-Glu干预增加了Bifidobacterium,Saccharibacteria＿genera＿incertae＿sedis属的相对丰度（P＜0.01,P＜0.05）。M-β-Glu干预增加了Lactobacillus,Bifidobacterium,Saccharibacteria＿genera＿incertae＿sedis以及Desulfovibrio属的相对丰度（P＜0.01,P＜0.001,P＜0.01,P＜0.01）。Desulfovibrio菌属的相对丰度在S-β-Glu和M-β-Glu组具有显著差异（P＜0.001）。此外,AD组小鼠粪便和海马组织中总SCFAs、乙酸与丙酸含量较对照组显著降低（均为P＜0.05）,而给予S-β-Glu和M-β-Glu干预,可以显著改善由Aβ导致的总SCFAs、乙酸和丙酸下降（均为P＜0.01）,四组小鼠粪便中丁酸的含量无显著差异,在海马组织中未检测到丁酸。关联性分析显示上述改变的有益细菌与认知能力和SCFAs呈现显著正相关,与脑内促炎因子及Aβ含量呈现显著负相关。代谢通路预测的结果提示菌群变化与包括AD在内的神经退行性疾病密切相关,同时提示和胰岛素信号通路密切相关。结论:侧脑室注射Aβ诱导AD小鼠出现肠道菌群紊乱,并且降低粪便和脑内SCFAs含量;而酵母β-葡聚糖可能作为益生元调节肠道菌群,通过增加有益细菌丰度,降低条件致病菌丰度以及增加SCFAs含量来维持肠道菌群稳态。M-β-Glu对调节肠道菌群组成以及差异物种的改变优于S-β-Glu。第三部分酵母β-葡聚糖通过调节肠道菌群改善阿尔茨海默病的相关机制初步探索目的:进一步探索酵母β-葡聚糖通过调节肠道菌群改善阿尔茨海默病的潜在机制。方法:动物分组及受试物同第一部分。每周记录小鼠12 h空腹血糖情况。并在干预第14天时,对禁食12 h后的小鼠进行2 h腹腔注射糖耐量测试（ip-GTT）;待小鼠恢复1周,在干预第21天时进行1 h腹腔注射胰岛素耐量测试（ip-ITT）。实验结束后,随机在每组小鼠中抽取3只小鼠进行心脏灌流,每组剩余小鼠处死后立即分离保存小鼠海马。通过ELISA测定ip-GTT所收集血浆中的胰岛素含量;通过免疫荧光技术对小鼠海马组织进行星形胶质细胞激活的标记（GFAP）和小胶质细胞激活的标记（IBA1）双重标记以检测胶质细胞活性,并结合MSD电化学发光检测小鼠海马组织中炎性因子水平;通过WB来检测小鼠海马组织内胰岛素通路相关蛋白含量及磷酸化水平。结果:ip-GTT、ip-ITT测试以及空腹血糖跟踪记录表明,AD组较对照组显示出胰岛素抵抗（IR）现象,并且AD组小鼠外周的胰岛素敏感性也显著低于其它三组小鼠。而S-β-Glu和M-β-Glu干预可减轻由Aβ引起的IR,同时对于胰岛素敏感性有显著提升,且相较于S-β-Glu,M-β-Glu的改善作用更为显著。脑内注射Aβ小鼠观察到胶质细胞异常活化,值得注意的是,S-β-Glu和M-β-Glu干预显著降低了活化的小胶质细胞（P＜0.05,P＜0.01）和星形胶质细胞数量（P＜0.05,P＜0.01）,同时,AD组小鼠的海马组织中TNFα、IL-1β、IL-6和INFγ的含量较对照组显著增高（P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001,P＜0.001）,IL-5和IL-10的含量较对照组显著降低（P＜0.01,P＜0.05）;与对照组相比,AD组小鼠中p-JNKThr183/Tyr185显著增多,进一步诱导p-IRS1Ser636/639显著增加,导致海马IR。同时,胰岛素信号通路下游关键蛋白p-AKTSer473和p-ERK1/2Thr202/Tyr204在AD组小鼠脑内较对照组显著降低,且p-GSK-3βSer9水平明显下降。而S-β-Glu和M-β-Glu干预可改善由Aβ导致的脑内IR,通过降低神经炎症,进而减少p-JNKThr183/Tyr185水平,降低p-IRS1Ser636/639水平,并且通过增加胰岛素信号通路关键蛋白p-AKTSer473和p-ERK1/2Thr202/Tyr204水平,增加p-GSK-3βSer9水平,进而降低p-TauSer404。结论:Aβ诱导AD小鼠脑内出现神经炎症,并引起胰岛素抵抗现象,而酵母β-葡聚糖可降低神经炎症和脑内胰岛素抵抗改善Aβ诱导的AD相关病理改变。综上所述,本研究观察到Aβ诱导AD小鼠出现肠道菌群紊乱,与炎性相关致病菌增加、益生菌下降、SCFAs下降,同时脑内出现神经炎症,导致胰岛素抵抗现象,最后造成神经元损伤、凋亡等和认知障碍。而酵母β-葡聚糖可调节肠道菌群稳态,降低神经炎症和脑内胰岛素抵抗改善Aβ诱导的AD相关病理改变。