【摘 要】
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背景和目的肝损伤的转归除病因外,还归因于宿主因素。作为中间丝蛋白最大亚群的角蛋白,目前有超过60种疾病与其突变相关。肝细胞成对表达的角蛋白K8/18突变易导致肝损伤加重。鉴于目前仍缺乏针对角蛋白相关疾病的特效治疗,我们设想通过药物筛选来寻找能够逆转突变角蛋白结构、恢复功能并发挥保护肝损伤的小分子化学物,这将为肝损伤提供新的治疗前景。方法利用A549细胞系转染GFP标记的角蛋白K18-R90C突变的
【基金项目】
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上海市教委优秀青年教师国外访学项目； 国家临床重点专科(感染科)建设项目； National Institutes of Health （NIH） grant R01 DK47918 （M.B.O.）；
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背景和目的肝损伤的转归除病因外,还归因于宿主因素。作为中间丝蛋白最大亚群的角蛋白,目前有超过60种疾病与其突变相关。肝细胞成对表达的角蛋白K8/18突变易导致肝损伤加重。鉴于目前仍缺乏针对角蛋白相关疾病的特效治疗,我们设想通过药物筛选来寻找能够逆转突变角蛋白结构、恢复功能并发挥保护肝损伤的小分子化学物,这将为肝损伤提供新的治疗前景。方法利用A549细胞系转染GFP标记的角蛋白K18-R90C突变的腺病毒,通过免疫荧光为基础的高通量药物筛选方法,以角蛋白结构变化为依据,来筛选能够使突变角蛋白点状片段减少、而丝状结构增多的小分子化学物。验证该小分子在突变细胞及转基因小鼠中的结构稳定作用,继而应用凋亡标记物、组织HE染色等检测其在Fas-L诱导细胞凋亡或肝脏损伤中的保护作用。进一步通过免疫共沉淀、多重免疫荧光、蛋白酶体活性测定、纯化蛋白体外装配实验等探究该小分子的作用机制。并拓展该小分子至其他角蛋白突变K14-R125C（引起单纯型大疱性表皮松懈症）、K18-D89H和K8-K393R（引起致死性药物性肝衰竭）相关疾病的研究。结果离子载体Monensin（莫能菌素,MN）以其速效、高能从10个候选小分子中脱颖而出。MN不仅使K18-R90C突变结构恢复到正常的丝状结构骨架,还能减轻Fas-L诱导的突变细胞的细胞凋亡和转基因小鼠的肝损伤。应用K18免疫共沉淀寻找可能的角蛋白结合伴侣,继之蛋白质谱和生化学验证,发现MN不改变网蛋白-1 m RNA水平且可增加网蛋白-1与角蛋白间的结合。同时,MN抑制自噬继而恢复受损的蛋白酶体活性,清除已泛素化修饰的异常角蛋白。此外,MN在纯化角蛋白体外装配实验中可改变角蛋白可溶性,从而证明其以一定方式直接作用于角蛋白。MN可逆转K14 R125C和K18 D89H基因突变导致的角蛋白结构异常,且为突变细胞提供抗凋亡保护,但并不能逆转K8 K393R基因突变导致的角蛋白结构异常。结论MN通过促进K8/18和网蛋白-1的结合,并抑制自噬继而恢复受损的蛋白酶体活性,从而逆转突变角蛋白结构,且为突变细胞提供抗凋亡保护,并减少转基因小鼠的肝脏损伤。因此,MN有望成为治疗角蛋白相关疾病特别是肝病领域一种新的药物。
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