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背景:黑色素瘤是世界上最具侵袭性的恶性肿瘤之一。在过去的几十年里,黑色素瘤的发病率一直在持续上升。肿瘤的早期诊断是非常重要的。因此,器官特异性生物标志物的发现迫在眉睫,这有助于及早发现黑素瘤,准确监测疾病进展并预测治疗效果。血红素氧合酶1(HO-1,32k Da)是一种重要的酶,它能催化血红素降解为胆绿素、一氧化碳和铁离子。许多人类肿瘤中的HO-1的表达水平上升,尤其是乳腺癌、甲状腺癌和口腔癌,通常与疾病分期和病人预后不良有关。HO-1促进癌细胞增殖,抑制化学毒性物质或紫外线照射引发的细胞凋亡。据报道,在细胞压力反应下HO-1转移到细胞核发挥独立于酶活性的许多重要功能,特别是转录调节。除了细胞定位影响HO-1的功能,异构体的产生可能也是影响HO-1功能的一种重要途径。在真核细胞中,内含子的存在极大地增加了基因表达的复杂性,这使得一个基因可以产生各种各样的蛋白质,这是通过一种叫做选择性剪接的过程来实现的。大多数人类基因转录本可以通过多种方式剪接而成。然而,HO-1的可变剪接体到目前为止还没有被报道过。本文鉴定了HO-1基因的一种新型选择性剪接形式,它是由移除3号外显子产生的,我们将它命名为14k Da HO-1。14 k Da HO-1被证明可以在体内和体外促进肿瘤细胞增殖和相对端粒长度的增加。目的:(1)验证HO-1基因除了编码传统的32k Da HO-1蛋白,还能通过转录本的选择性剪接编码新的异构体。在四种不同细胞(A375、OSC-19、SCC-15和FEK4)中证明m RNA水平和蛋白水平的14k Da HO-1存在。(2)在原代细胞(FEK4、NHDF、melanocytes和HPd LF)和永生化细胞(Ha Ca T、A375、OSC-19、SCC-15和CAL-27)中检测14k Da HO-1转录水平的差异。(3)检测14k Da HO-1是否与32k Da HO-1类似能被不同浓度的UV(0、30、60和90k J/m2)和H2O2(0、50和100μM)诱导。UV(60 k J/m2)照射后,观察两种蛋白的亚细胞定位。(4)建立14k Da HO-1过表达FEK4细胞系和14k Da HO-1敲低A375细胞系。首先探究14k Da HO-1对细胞周期的影响。然后进一步检测对原代细胞和肿瘤细胞增殖和端粒长度的影响。(5)在肿瘤异种移植模型中探究14k Da HO-1低表达对黑色素瘤增殖和端粒长度的影响。研究方法:基因测序分析HO-1可变剪接体序列,BLAST比对找出发生选择性剪接导致丢失的核苷酸序列和氨基酸序列;构建32k Da HO-1和14k Da HO-1过表达载体,构建14k Da HO-1过表达FEK4稳定细胞系,构建14k Da HO-1敲低A375稳定细胞系;PCR检测14k Da HO-1的m RNA水平,Western blotting检测其编码的蛋白质;q PCR定量检测32k Da HO-1和14k Da HO-1的m RNA表达差异和端粒长度;免疫荧光检测14k Da HO-1和32k Da HO-1的亚细胞定位;流式细胞术检测14k Da HO-1过表达对FEK4细胞周期的影响;CCK-8和结晶紫着色检测32k Da HO-1和14k Da HO-1过表达对FEK4和A375细胞增殖的影响;肿瘤异种移植模型探究14k Da HO-1低表达对黑色素瘤增殖的影响。结果:(1)14k Da HO-1是HO-1的一种新型可变剪接体:与32k Da HO-1相比,14k Da HO-1是由选择性剪接移除3号外显子形成的,其编码的蛋白质缺失164个氨基酸。蛋白结构分析显示14k Da HO-1缺失了与血红素(Heme)的结合区域。(2)14k Da HO-1在原代细胞和永生化细胞中差异性表达:14k Da HO-1在永生化细胞(Ha Ca T、A375、OSC-19、SCC-15和CAL-27)中的表达总体水平高于原代细胞(FEK4、NHDF、melanocytes和HPd LF),而32k Da HO-1的表达无显著差异。(3)14k Da HO-1能被UV和H2O2诱导:与32k Da HO-1类似,14k Da HO-1在不同剂量UV(0、30、60和90k J/m2)和H2O2(0、50和100μM)诱导下表达,且具有剂量依耐性。32k Da HO-1在UV(60k J/m2)处理后入核,相反的是14k Da HO-1定位于细胞质。(4)14k Da HO-1促细胞增值和端粒加长:14k Da HO-1过表达减少FEK4 G1期的细胞比例,增加了S期和G2期的细胞比例。CCK8和结晶紫染色显示14k Da HO-1过表达促FEK4细胞增殖,增加端粒长度。敲低14k Da HO-1抑制A375细胞增值,减少端粒长度。(5)敲低14k Da HO-1抑制黑色素瘤增殖:通过使用A375细胞进行肿瘤异种移植,与scramble对照相比sh-14k Da HO-1抑制了肿瘤生长,缩短了肿瘤组织细胞的端粒长度。结论:HO-1基因的pre-m RNA通过选择性剪接修饰移除3号外显子形成了一种新型可变剪接体,其编码的蛋白质分子量为14k Da。与传统的32k Da HO-1相比,14k Da HO-1更容易被UV诱导表达且定位于细胞质。14k Da HO-1具有促细胞增殖和增加端粒长度的功能。14k Da HO-1过表达促进FEK4细胞增殖和相对端粒长度增加。在肿瘤异种移植实验中,敲低14k Da HO-1表达能抑制黑色素瘤组织细胞的生长和缩短端粒相对长度。