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目的骨关节炎(OA)是一种常见的,影响大众尤其是中老年人群正常活动的主要关节疾病,给个人和社会带来了巨大的身心和经济上的负担。本病的发病趋势没有明显的种族和地域性,发病机制涉及形态学,生化,代谢等多方面的改变。在骨关节炎的病理改变中,大量炎性介质的释放是造成局部关节改变的重要因素。这些促炎性因子中,IL-1, TNF无疑扮演了重要的角色。针对这些细胞因子的生物学功能研制开发了一系列的治疗手段。随着该领域研究的进展,骨关节炎的病理改变中滑膜组织所起到的作用也得到了越来越多的重视。滑膜组织释放的炎性介质造成关节内软骨基质的降解,加重关节局部炎性改变。而其本身的过度增生也是导致关节本身退化、局部肿胀的重要因素之一,并引发了包括疼痛以及局部功能障碍等一系列临床表现。本实验中,我们使用基因治疗的方法,利用重组腺相关病毒载体(rAAV),将外源性抑炎性因子基因联合自杀基因导入体外培养的滑膜细胞,试图减少滑膜细胞促炎性因子的释放并抑制过度增生的滑膜细胞,以此来达到治疗骨关节炎的目的。方法利用rAAV,将抗炎因子白介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)联合单纯疱疹病毒-胸苷激酶(HSV-tk)自杀基因系统引入体外培养的滑膜细胞,观察其在抑制促炎性因子分泌以及诱导靶细胞死亡以控制滑膜细胞增生的效果。所有实验分组除非特殊说明否则均为：A组导入IL-1Ra基因,B组导入HSV-tk基因,C组导入IL-1Ra联合HSV-tk基因,D组为对照组,转染含空质粒的rAAV。首先,我们利用携带报告基因EGFP的病毒载体转染滑膜细胞以此来观测该病毒载体转染体外培养细胞的情况并确定最佳的转染条件。涉及更昔洛韦(GCV)的细胞毒作用,我们分别设置HSV-tk(-)组和HSV-tk(+)组等两组独立实验；GCV的浓度分5组为0.1、1、10、100、1000(单位：μg/ml);设置时间段为24小时至96小时,4个时间段进行检测,时间间隔为24小时,利用MTT检测细胞生长抑制情况。自杀基因的旁观者效应同样采用MTT。目的基因,包括：IL-1Ra、IL-1β、TNF-α、HSV-tk,其表达量我们使用了real-time PCR进行分析,并用相对定量的方法—2-ΔΔCT进行表达量的分析。涉及相关因子包括：IL-1 Ra、IL-1β、TNF-a的含量水平的表达则利用ELISA进行检测。最后,利用流式细胞术检测由自杀基因诱导的靶细胞凋亡情况。采用AnnexinⅤ-FITC-PI双染法进行滑膜细胞凋亡的测定。结果首先,就自杀基因HSV-tk以及其产生的旁观者效应来看,结果发现：HSV-tk(-)组细胞生长抑制情况基本呈浓度依赖的正相关,但不同GCV浓度以及不同时间段对比缺乏统计学差异；反观HSV-tk(+)组,除去表现出的GCV浓度依赖关系外,不同时间段以及不同药物剂量分组间有统计学差异。根据该实验结果,我们选取了GCV浓度为100μg/ml,给药后72小时为后续实验的基础条件。旁观者效应的MTT分析中我们发现：HSV-tk(+)细胞所占比例为50%时细胞生长抑制率为77.31±5.44%。通过分析认为该自杀基因阳性细胞比例使实验结果最优化。结果以平均值±S.D表示,n=3,P<0.05。在real-time PCR对目的基因表达量的检测中,IL-1Ra基因的表达量在A组和C组分别为66.49±10.85,117.63±21.88,而未导入IL-1Ra基因的B组为24.42±5.83。IL-1p的表达量在A、B、C三组分别下降至0.028±0.017,0.102±0.034和0.017±0.005。同样,自杀基因HSV-tk在被导入了该基因的B、C两组表达显著,分别是252.663±53.673和513.867±120.821。而未导入该基因的A组表达量为6.720±2.429.然而,这种统计学的改变在TNF-a的基因表达上并不明显,三组实验组A、B、C的表达量分别是3.563±2.511,5.523±2.285,1.017±0.162。结果以平均值±SEM来表示,n=3,P<0.05。相似的趋势在蛋白水平的测定上也可发现,通过ELISA的检测,IL-1Ra的水平在A组达到56.723±6.563 pg/ml,B组为30.790±8.431 pg/ml C组76.277±10.380pg/ml,而对照组D组为11.467±3.657pg/ml。相应的,IL-1β在A组的水平下降到14.343±4.232 pg/ml,B组为21.300±5.112 pg/ml,C组为6.534±2.353 pg/ml,相比较D组则是52.287±9.636 pg/ml。同样,TNF-a通过ELISA检测也缺乏相应的变化。其水平在三个实验组A、B、C分别为9.733±5.804 pg/ml,14.247±2.255 pg/ml,6.527±3.785 pg/ml,而在对照组D则为4.637±2.799 pg/ml。统计结果以平均值±SEM表示,n=3,P<0.05。对于自杀基因诱导细胞死亡的过程,72小时给予GCV后,倒置显微镜下可观察到大批贴壁细胞漂浮在培养液中,利用流式细胞术检测,在导入HSV-tk的B、C两组,细胞的凋亡率分别为65.70%和69.40%,而在未导入HSV-tk的A组以及对照组D则为7.88%和6.89%。结论体外实验中,我们将携带目的基因的腺相关病毒载体转染培养的滑膜细胞使其表达相应的目的基因。并且根据实验结果我们发现,IL-1Ra基因联合自杀基因HSV-tk对于骨关节炎的基因治疗较单纯的使用IL-1Ra或HSV-tk不仅可以有效地减少主要促炎性因子—IL-1β的含量,同时还可以抑制滑膜细胞的过度增生,以此来达到治疗的目的。